苯中毒的骨髓造血細胞microRNA表達譜與miR-34a-5p對苯毒性的調控研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　苯暴露可導致機體產生造血毒性，導致造血系統(tǒng)疾病的發(fā)生，其毒性機制主要是抑制骨髓造血干細胞的增殖與分化功能。miRNA是一類非編碼小分子RNA，參與多種生理和病理過程的調控，包括造血干細胞的自我更新、分化和造血微環(huán)境間的調控。最近的研究發(fā)現特定的miRNA與外源性有害物質暴露產生的毒性作用之間具有相關性，但是miRNA在苯暴露導致的骨髓造血細胞中的調控作用并不清楚。本研究通過構建苯中毒小鼠模型，在骨髓Lin-細

2、胞水平對苯中毒導致的miRNA差異表達譜進行分析，并驗證差異表達的造血相關miRNA在骨髓造血祖細胞(Lin-c-Kit+)水平的表達。通過苯暴露導致的骨髓造血細胞miRNA差異表達譜結合苯暴露后小鼠骨髓造血細胞的差異蛋白表達譜對造血相關miRNA進行miRNA-mRNA共表達調控網絡分析，篩選出miR-34a-5p在其中發(fā)揮主要調控作用;構建miR-34a-5p過表達和表達抑制的K562細胞模型，在此基礎上研究miR-34a-5p在1

3、，4-BQ對K562細胞毒性中發(fā)揮的生物學功能;在K562細胞中識別并驗證miR-34a-5p的靶基因，研究miR-34a-5p的靶基因在1，4-BQ對K562細胞毒性中發(fā)揮的調控作用;研究miR-34a-5p在病例組和對照組人群中的表達水平，為苯中毒機制及生物標志提供新的科學線索和依據。
　　第一章苯中毒小鼠骨髓造血細胞的miRNA表達譜
　　以雄性C57BL/6小鼠為實驗對象，采用皮下注射的方式進行染毒，苯染毒組濃度為1

4、50 mg/(kg-b.w.)，每周染毒5天，連續(xù)染毒4周，對照組小鼠皮下注射同等劑量的食用調和油。染毒結束后對小鼠的一般毒性和造血毒性進行評價，其中一般毒性包括體重和臟器系數，造血毒性包括血常規(guī)、造血干細胞比例和骨髓細胞內ROS水平。結果顯示苯染毒可導致小鼠體重和胸腺體比顯著降低(p＜0.05)。外周血檢測結果顯示苯染毒組小鼠外周血白細胞、紅細胞、淋巴細胞明顯低于對照組(p＜0.05)。流式細胞儀檢測骨髓中造血細胞比例的結果表明苯暴露

5、可導致骨髓Lin-c-Kit+細胞和造血干細胞(Lin-c-KitSca-1+)的比例明顯低于對照組(P＜0.05)。苯染毒組小鼠骨髓中造血干細胞的ROS水平明顯高于對照組，具有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。
　　在上述苯中毒小鼠模型基礎上，通過流式細胞儀分選出骨髓Lin-細胞，提取RNA后進行Illumina測序篩選出與苯暴露相關的miRNA差異表達譜。與陰性對照組小鼠相比，苯中毒組小鼠骨髓Lin-細胞中有45個miRNA表達下調

6、，5個miRNA表達上調。
　　第二章苯中毒造血相關差異表達miRNA的篩選及信號通路富集分析
　　應用qRT-PCR在骨髓Lin-細胞水平對8個造血相關miRNA(mmu-miR-34a-5p、mmu-miR-129b-5p、mmu-miR-451 a、mmu-miR-144-5p、mmu-miR-342-3p、mmu-miR-196b-5p、mmu-miR-100-5p和mmu-miR-181 a-5p)的表達水平進行檢

7、測并驗證。結果顯示，qRT-PCR與Illumina測序的結果一致，即苯暴露可導致骨髓Lin-細胞中mmu-miR-34a-5p、mmu-miR-129b-5p、mmu-miR-451a和mmu-miR-144-5p的表達上調，mmu-miR-342-3p、mmu-miR-196b-5p、mmu-miR-100-5p和mmu-miR-181 a-5p的表達下調。進一步在骨髓Lin-c-Kit+細胞水平對差異表達的造血相關miRNA的表達

8、進行檢測。結果顯示，苯暴露可導致mmu-miR-34a-5p、mmu-miR-342-3p、mmu-miR-196b-5p、mmu-miR-100-5p和mmu-miR-181a-5p的表達在骨髓Lin-c-Kit+細胞水平發(fā)生改變，表達趨勢與骨髓Lin-細胞一致。
　　通過比對上述8個造血相關miRNA在人和小鼠中的序列，發(fā)現miR-34a-5p、miR-451a、miR-100-5p、miR-181a-5p、miR-196b-

9、5p和miR-342-3p在人和小鼠中具有同源性。通過靶基因預測軟件結合苯暴露后小鼠骨髓造血細胞的差異蛋白表達譜的結果對造血相關miRNA的靶基因進行分析，利用DAVID在線分析數據庫對靶基因參與的KEGG信號通路分析，結果顯示這些靶基因主要參與的信號通路有鈣信號轉導通路、促性腺激素釋放激素信號通路、卵母細胞減數分裂、長時程增強、細胞骨架調控、ErbB信號傳導途徑、MAPK信號通路、Wnt信號通路和細胞周期。在此基礎上對差異表達的造血相

10、關miRNA構建miRNA-mRNA的共表達調控網絡，結果提示表達上調的miR-34a-5p可能通過靶向調控多種靶基因參與上述信號通路在苯誘導的造血毒性中發(fā)揮主要調控作用，其次是表達下調的miR-342-3p和miR-196b-5p。
　　第三章 miR-34a-5p在1，4-BQ致K562細胞毒性中的生物學功能
　　構建苯的代謝終產物1，4-BQ暴露的K562細胞模型，采用qRT-PCR方法檢測1，4-BQ染毒K562細胞

11、后miR-34a-5p的表達改變。結果表明，miR-34a-5p的表達隨著1，4-BQ染毒濃度的增加及染毒時間的延長逐漸增加，呈現一定的劑量效應關系和時間效應關系。因此后續(xù)實驗選擇在細胞模型與動物模型一致的miR-34a-5p。同時在該細胞模型上研究1，4-BQ對K562細胞的毒性作用，包括細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、細胞分化和ROS。細胞增殖的結果表明隨著1，4-BQ染毒濃度和染毒時間的增加，K562細胞的增殖率逐漸降低。細胞周期的

12、結果顯示，G0/G1期和G2期細胞比例隨著染毒濃度的增加而降低，S期細胞比例隨著染毒濃度的增加而增加。細胞凋亡的結果顯示1，4-BQ可顯著增加K562細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率，呈現一定的劑量效應關系和時間效應關系。流式細胞儀檢測1，4-BQ染毒K562.細胞對其向巨核細胞分化的影響，結果顯示較高濃度1，4-BQ(20μM和40μM)可顯著增加CD41a的表達，促進K562細胞向巨核細胞分化。1，4-BQ染毒K562細胞2h可促使細胞

13、內ROS顯著增加。
　　通過qRT-PCR確定miR-34a-5p mimic和inhibitor轉染K562細胞的最佳轉染條件。qRT-PCR的結果表明K562細胞轉染30 nM mimic和200 nM inhibitor24h可顯著增加和降低miR-34a-5p的表達(p＜0.05)，因此后續(xù)研究選擇該轉染濃度模擬miR-34a-5p過表達和表達抑制在1,4-BQ致K562細胞毒性中的生物學作用。結果表明，抑制K562細胞中

14、miR-34a-5p的表達可抑制1，4-BQ對K562細胞的增殖毒性作用，如K562細胞轉染miR-34a-5p inhibitor后，20μM1，4-BQ染毒組再染毒24h，K562細胞增殖率高于陰性轉染組(p＜0.05)。細胞周期的結果表明，與陰性轉染組相比，K562細胞轉染miR-34a-5p mimic后用20μM1，4-BQ染毒24 h可導致K562細胞S期細胞比例增加(p＜0.05)。細胞分化的結果表明，與陰性轉染組相比，在

15、K562細胞中過表達miR-34a-5p可促進20μM1，4-BQ染毒過程中向巨核細胞分化(p＜0.05)。細胞凋亡和ROS的結果表明，miR-34a-5p對1，4-BQ致K562細胞凋亡和ROS的毒性作用沒有影響。
　　第四章 miR-34a-5p在1,4-BQ致K562細胞毒性中的調控機制
　　通過靶基因預測軟件結合小鼠苯暴露后骨髓造血細胞的差異蛋白表達譜的結果及miR-34a-5p可參與調控K562細胞的細胞周期的結果

16、，初步篩選出miR-34a-5p的候選靶基因STAG1、STAG2和PCNA。qRT-PCR結果顯示miR-34a-5p mimic和inhibitor轉染至K562細胞后，候選靶基因STAG1、STAG2和PCNA在mRNA水平未發(fā)生明顯改變。Western blot檢測結果表明在K562細胞中高表達miR-34a-5p可抑制STAG1和STAG2的蛋白表達，抑制miR-34a-5p的表達可促進STAG1和STAG2的蛋白表達，且差異

17、具有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，改變K562細胞中miR-34a-5p的表達對PCNA的蛋白表達沒有影響。雙熒光素酶報告基因實驗表明過表達miR-34a-5p可導致含有野生型STAG13'UTR和STAG23'UTR的熒光素酶活性下降(p＜0.05)，說明miR-34a-5p可通過與STAG1和STAG2的3'UTR區(qū)結合直接靶向調節(jié)STAG1和STAG2。
　　為了進一步研究miR-34a-5p在miR-34a-5p在1，4-B

18、Q致K562細胞毒性中的調控機制，Western blot檢測了miR-34a-5p的靶基因在1，4-BQ染毒K562細胞過程中的表達改變。結果表明與陰性轉染組相比，K562細胞轉染miR-34a-5p mimic24 h可顯著降低20μM1，4-BQ染毒24 h后STAG1和STAG2的蛋白表達水平，分別是陰性轉染組的0.41和0.79，而轉染inhibitor后可顯著增加20μM1，4-BQ染毒24 h后STAG1和STAG2的蛋白

19、表達水平，分別是陰性轉染組的1.76和3.18倍，且與陰性轉染組對比具有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。
　　第五章 miR-34a-5p對職業(yè)苯暴露人群血液毒性的影響
　　收集苯暴露人群外周血樣本，根據血常規(guī)檢查及復查的白細胞計數將苯作業(yè)人員分為對照組(WBC≥4.5×109/L)和病例組(WBC＜4.5×109/L)，按年齡和性別進行1∶1配對，每組各35例，研究暴露于同樣苯環(huán)境的對照組和病例組人群外周血中miR-34a-5

20、p的表達是否存在差異?？ǚ椒治龅慕Y果顯示本研究納入的對照組和病例組人群的年齡、性別、吸煙和飲酒都沒有統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。qRT-PCR結果表明病例組人群外周血中miR-34a-5p的表達水平是對照組人群的1.91倍，且具有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。因此miR-34a-5p的表達上調可能與苯暴露導致苯中毒之間具有一定的相關性。
　　總結
　　本研究成功構建苯中毒小鼠模型，結果表明苯對造血系統(tǒng)的毒性作用主要是抑制骨髓造

21、血干細胞的增殖與分化功能。通過Illumina測序發(fā)現苯暴露可導致骨髓Lin-細胞的microRNA表達譜發(fā)生改變。qRT-PCR方法驗證了Illumina測序結果的準確性，并且驗證了苯暴露可在骨髓Lin-c-Kit+細胞水平導致造血相關miRNA的表達發(fā)生改變。通過苯暴露骨髓Lin-c-Kit+細胞中異常表達的miRNA與差異蛋白表達譜構建miRNA-mRNA共表達調控網絡，結果發(fā)現miR-34a-5p可能通過鈣信號轉導通路、卵母細胞

22、減數分裂、ErbB信號傳導途徑、Wnt信號通路、MAPK信號通路和細胞周期等信號通路參與苯誘導的造血毒性。
　　通過構建miR-34a-5p過表達和表達抑制的K562細胞模型，結果表明miR-34a-5p可與細胞周期信號通路相關基因STAG1和STAG2的3'UTR區(qū)結合，在蛋白水平調控STAG1和STAG2的表達，從而影響K562細胞的細胞周期分布。進一步通過1，4-BQ染毒miR-34a-5p過表達和表達抑制的K562細胞，結

23、果表明抑制K562細胞中miR-34a-5p的表達可抑制1，4-BQ對K562細胞的增殖毒性作用。miR-34a-5p可通過調控STAG1和STAG2的蛋白表達影響1，4-BQ染毒過程中K562細胞的細胞周期分布，從而影響苯及其代謝終產物誘導的造血毒性作用。
　　與對照組人群相比，miR-34a-5p在病例組人群外周血中呈表達上調趨勢，說明miR-34a-5p的表達增加可能促進苯暴露人群發(fā)生苯中毒。
　　綜上，本課題首次在骨