毒蕈堿型乙酰膽堿受體M2和M4的內吞及內吞后轉運的分子機制研究.pdf

1、G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的內吞和內吞后的轉運對于細胞表面受體含量及信號的控制是十分重要的。在激動劑刺激條件下，大多數的GPCR通過網格蛋白依賴的內吞（CDE）途徑進入細胞內部，它們被募集到網格蛋白包被小泡（CCP）中，CCP成熟后形成網格蛋白包被囊泡（CCV）并運送GPCR分子進入到早期內涵體（EEs）中，在此被分選進入降解或者回收的途徑。然而，有些 GPCR可以通過非網格蛋白依賴的內吞（CIE）途徑進入細胞內部。CIE內吞途徑包括

2、依賴驅動蛋白（dynamin）的小窩（caveolae）和一些不依賴dynamin的途徑。與CDE途徑的機制不同，調控GPCR信號的CIE途徑機制仍然存在許多空白。
　　毒蕈堿型乙酰膽堿受體（mAChRs）屬于A家族GPCR。其中結構和功能都類似的兩種亞型M2和M4，它們的內吞途徑和胞內轉運機制都不相同：M4經由CDE途徑進入到循含內涵體中（REs）并循環(huán)上膜；而M2經由CIE途徑進入到溶酶體（lysosomes）中并被降解。本文

3、中通過比較 M2和 M4的第三個胞內環(huán)狀區(qū)域（i3 loop）的序列差異，在HKE293細胞中研究M2和M4的內吞和轉運機制，取得了如下結果：
　?。?）發(fā)現了CIE途徑內吞也可以是序列依賴的過程。mAChRs含有較短的C-尾部，但具有特別長的第三段胞內環(huán)（i3 loop）。I3 loop中含有mAChRs的G-蛋白結合位點和磷酸化位點，同時對于受體的內吞和內吞后轉運是至關重要的。據報道，V373-A393序列的切除能夠阻止M4的

4、內吞，而將含有21個氨基酸的該段序列進一步縮短，發(fā)現其中8個氨基酸的序列R396-A393足以決定M4的內吞。同時，在M2受體中，切除了與V373-A393同一位置的20個氨基酸序列V361-S380，發(fā)現M2不能內吞?；诖私Y果，第一次發(fā)現了決定M2的CIE途徑的短序列374KKKPPPS380。將374KKKPPPS380置換M4的對應序列，發(fā)現M4的內吞由 CDE轉變?yōu)?CIE模式。同時鑒定了在此序列上游的序列361VARKIVK

5、MTKQPA373能夠引導 M2進入 CDE模式，但是該內吞途徑被374KKKPPPS380所屏蔽。
　?。?）發(fā)現的決定CIE內吞方式的序列可能參與了mAChR的溶酶體定位和降解。據報道，V373-A393對于M4的循環(huán)上膜是必須的?；谝陨系陌l(fā)現，設計實驗來驗證374KKKPPPS380是否影響M2的降解。M2受體切除掉序列374KKKPPPS380導致內吞方式由CIE轉變?yōu)镃DE，但是并不能影響M2被轉運到溶酶體的命運。在激

6、動劑刺激下，該缺失突變體顯示出與溶酶體標記分子 LAMP-1明顯的共定位，而并不與循環(huán)內涵體標記分子Rab11共定位。而且，將374KKKPPPS380置換M4的對應序列，發(fā)現M4也會定位于LAMP-1標記的溶酶體中。綜合上述，揭示了GPCR的內吞和降解都是可能依賴自身序列的。
　　(3)發(fā)現了內吞方式的改變對mAChR的活性可能沒有影響。在激動劑的刺激下，ERK1/2在表達有mAChR的細胞中會被磷酸化。在研究中，系統(tǒng)地考察了激