NMDA受體抑制劑MK-801抑制大鼠蜜蜂毒炎性痛所致脊髓后角小膠質細胞的激活.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:脊髓是軀體感覺信息傳入和整合的初級中樞。近年研究表明,脊髓后角小膠質細胞在病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮重要的作用。研究結果顯示,多種傷害性刺激都可以使脊髓后角的小膠質細胞激活,使之釋放白介素-1β、腫瘤壞死因子-α等多種細胞因子,對傳導病理性疼痛和產(chǎn)生痛覺過敏起到促進作用。給予P2X4受體阻斷劑TNP-ATP(2',3'-O-(2,4,6-trini-trophenyl)ATP)、米諾環(huán)素等抑制小膠質細胞功能的藥物,可明顯抑制病理

2、性疼痛和痛過敏的產(chǎn)生。這些研究成果表明在病理性疼痛和痛過敏的產(chǎn)生和維持中,脊髓小膠質細胞的活化發(fā)揮了重要作用。但脊髓小膠質細胞被傷害性傳入信息激活的機制尚不完全清楚。
   N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)是脊髓后角中重要的神經(jīng)遞質,其受體在脊髓后角,包括小膠質細胞上廣泛分布。NMDA及其受體系統(tǒng)在向中樞傳遞外周傷害性信息,誘導痛覺中樞敏感化方面發(fā)揮重要作用。蜜蜂毒(beevenom

3、,BV)疼痛模型是研究炎性病理性痛的良好模型。此模型是將蜜蜂毒溶液注入大鼠足底皮下中心部位,導致足底組織發(fā)炎紅腫,并引起單相自發(fā)痛反應,在注射部位還可以產(chǎn)生原發(fā)性的痛過敏,持續(xù)時間長達數(shù)天。我室既往應用免疫印跡分析(westernblotanalysis)技術,初步觀察了蜜蜂毒炎性疼痛模型中脊髓后角小膠質細胞的激活、以及NMDA受體在其中所發(fā)揮的作用。
   本實驗則應用免疫組化技術,進一步研究蜜蜂毒炎性痛引起的脊髓后角小膠質細

4、胞的激活情況、以及NMDA受體在此過程中的作用,為闡明病理性痛過程中小膠質細胞的激活機制提供進一步的實驗依據(jù)。
   1、蜜蜂毒炎性痛大鼠脊髓后角小膠質細胞激活的動態(tài)過程
   方法:雄性Sprague-Dawley大鼠30只,體重230~270g,隨機分為6組:sham1h組、sham1d組、蜜蜂毒1h組、蜜蜂毒1d組、蜜蜂毒3d組和蜜蜂毒7d組(每組n=5)。分別將50μl生理鹽水或50μl蜜蜂毒溶液(4g·L-1)

5、注入sham組和蜜蜂毒組大鼠右后足底皮下。Sham1h組和蜜蜂毒1h組動物在測定足底注射后60min內的自發(fā)痛反應后取材,其它各組于相應時間點測定注射部位的熱痛敏和機械痛敏后取材。取材部位為腰5(L5)脊髓節(jié)段。將L5脊髓節(jié)段經(jīng)多聚甲醛固定后,常規(guī)冰凍切片,應用免疫組化技術,觀察脊髓后角OX-42蛋白的表達情況,評價小膠質細胞的激活狀態(tài)。
   實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x-±s)表示。用社會科學統(tǒng)計程序(StatisticalP

6、rogramforSocialSciences13.0)對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-WayANOVA),比較組間差異。有顯著差異者用最小顯著差法進行兩兩比較,判斷差異顯著性的標準為P<0.05。
   結果:所有蜜蜂毒組大鼠在注射蜜蜂毒后,均產(chǎn)生注射側單相性的自發(fā)痛反應,表現(xiàn)為自發(fā)抬足、舔咬足行為,持續(xù)時間超過60min。sham組大鼠則無自發(fā)痛反應。蜜蜂毒組大鼠注射蜜蜂毒后1d、3d、7d均產(chǎn)生了明顯的熱痛敏和機械痛

7、敏(P<0.05),注射后1d為痛覺過敏的高峰,3d、7d逐漸減弱。
   免疫組化染色顯示,與sham組相比,大鼠在注射蜜蜂毒后1h,L5脊髓節(jié)段后角小膠質細胞形態(tài)和OX-42的表達未見明顯變化。在注射蜜蜂毒后1d時,可見小膠質細胞胞體開始變大,細胞突起增粗,OX-42的表達顯著升高(P<0.05)。小膠質細胞OX-42的表達和形態(tài)變化在注射后3d達到高峰。注射后7d表達依然明顯,但較之3d時有所減弱。以上結果表明,脊髓后角小

8、膠質細胞受到蜜蜂毒炎性痛的刺激后明顯激活,其動態(tài)變化趨勢為:1d開始明顯,3d達到高峰,7d開始減弱。
   2、NMDA受體抑制劑MK-801對大鼠蜜蜂毒炎性痛所致脊髓后角小膠質細胞激活的影響
   方法:雄性Sprague-Dawley大鼠25只,體重230~270g,隨機分為以下5組(n=5):①sham組:大鼠足底注射NS50μl。②蜜蜂毒組:大鼠足底注射蜜蜂毒溶液50μl(4gL-1)。③蜜蜂毒+MK-801組

9、:MK-801溶液10μl(50nmol)注入大鼠椎管內,間隔15min后大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液50μl(4gL-1)。④蜜蜂毒+NS組:生理鹽水10μl注入大鼠椎管內,間隔15min后,大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液50μl(4gL-1)。⑤sham+MK-801組:MK-801溶液10μl(50nmol)注入大鼠椎管內,間隔15min后,大鼠右后足底皮下注射生理鹽水50μl。
   測定所有大鼠足底注射后60min內

10、的自發(fā)痛反應,并于注射后3d時測定熱痛敏和機械痛敏。之后,深麻醉下灌注后,取腰5(L5)脊髓節(jié)段,冰凍切片后,應用免疫組化技術,觀察脊髓后角小膠質細胞的激活狀態(tài)和OX-42蛋白的表達量。上一組實驗結果顯示,在注射蜜蜂毒后3d,大鼠L5脊髓節(jié)段后角小膠質細胞激活狀態(tài)最明顯,所以本組實驗選取足底注射后3d的時間點,觀察NMDA受體抑制劑MK-801對脊髓后角小膠質細胞激活的影響。
   實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x-±s)表示。用社會

11、科學統(tǒng)計程序(StatisticalProgramforSocialSciences13.0)對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-WayANOVA),比較組間差異。有顯著差異者用最小顯著差法進行兩兩比較,判斷差異顯著性的標準為P<0.05。
   結果:蜜蜂毒組大鼠在足底注射蜂毒后產(chǎn)生明顯的自發(fā)痛行為反應,與sham組相比,其痛行為評分明顯增高(P<0.05)。而在蜜蜂毒+MK-801組,給予MK-801明顯抑制了蜜蜂毒引起的

12、痛行為評分增高(P<0.05)。蜜蜂毒組大鼠的熱痛覺潛伏期和機械縮足閾值明顯下降(P<0.05),而在蜜蜂毒+MK-801組,給予MK-801明顯抑制了蜜蜂毒引起的熱痛覺潛伏期和機械縮足閾值的下降(P<0.05)。
   免疫組化染色顯示,大鼠注射蜜蜂毒后3d,脊髓后角小膠質細胞較sham組明顯激活,其OX-42表達顯著升高(P<0.05)。椎管內注射MK-801對足底注射蜜蜂毒引起的脊髓后角小膠質細胞的激活有明顯抑制作用,表現(xiàn)

13、為與蜜蜂毒組相比,其OX-42的表達明顯下降(P<0.05),小膠質細胞的激活狀態(tài)明顯減輕。椎管內注射MK-801對sham大鼠脊髓后角OX-42的表達和小膠質細胞的激活狀態(tài)無明顯影響。以上結果表明NMDA受體抑制劑MK-801對大鼠小膠質細胞的激活產(chǎn)生了抑制作用。
   結論:本研究應用免疫組化方法發(fā)現(xiàn),蜜蜂毒引起的炎性痛導致脊髓后角小膠質細胞呈現(xiàn)動態(tài)變化;NMDA受體抑制劑MK-801可明顯抑制小膠質細胞的活化,并有效抑制了

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