PI3Kp110β參與調(diào)控人胚胎干細胞分化為胰島樣細胞的研究.pdf

1、背景和目的：
　　目前1型糖尿病和部分2型糖尿病患者仍需終身依賴外源性胰島素治療，且不能改善遠期并發(fā)癥。近年胰島器官移植的成功提示了胰島細胞可以彌補胰腺細胞的不足而用于治療糖尿病，但供體的嚴重不足限制了其在臨床的應(yīng)用。而移植由人胚胎干細胞誘導分化而來的胰島素分泌細胞可能有助于解決供體不足的問題。至目前為止，大多數(shù)誘導分化方案獲得的胰島樣細胞共表達胰高血糖素和/或生長抑素，仍不是功能完善的β細胞。在我們前期研究中，在末階段添加外源性

2、誘導因子Exendin-4得到C肽陽性細胞率高達90％，大大提高了胚胎干細胞的分化效率，但其共表達四種胰腺特異蛋白，屬于不成熟的胰島前體細胞。
　　Hori等在鼠胚胎干細胞分化末階段采用PI3K抑制劑 LY294002成功獲得95%-97%的胰島素陽性細胞，僅有2%-3%的胰高血糖素陽性細胞。但其干細胞來源于小鼠，且在培養(yǎng)中使用了血清培養(yǎng)基，這些動物源性因素限制了分化細胞的臨床應(yīng)用。PI3K分為四個亞型，被廣泛研究的IA類PI3K

3、主要由p110催化亞基（p110α，β，δ）和p85調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成的異源二聚體組成。然而究竟是何種構(gòu)型的PI3K異二聚體參與人胚胎干細胞的定向分化還未見有所報導。因此，本實驗嘗試在無血清培養(yǎng)條件下，在誘導末階段采用PI3K抑制劑LY294002誘導人胚胎干細胞定向分化，以期獲得更加成熟的胰島素分泌細胞；采用PI3KP110β抑制劑TGX-221初步探索PI3Kp110β對人胚胎干細胞定向分化的影響。
　　材料和方法：
　　1.

4、人胚胎干細胞單克隆細胞系 PKU1.1由北京大學第三醫(yī)院生殖醫(yī)學中心陳貴安教授贈送。采用“五步誘導法”包括：人胚胎干細胞體外培養(yǎng)（HES階段）；擬胚體的形成（EB階段）；通過ITSF液篩選巢蛋白陽性細胞（ITS階段）；添加B27、N2以及堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）擴增巢蛋白陽性細胞（N2階段）；去除 bFGF，添加廣譜的PI3K抑制劑LY294002誘導因子為實驗組，

5、添加前期研究采用的Exendin-4因子為對照組分別誘導人胚胎干細胞向胰島樣細胞的定向分化；添加 PI3KP110β特異性抑制劑TGX-221因子用于檢測PI3KP110β對人胚胎干細胞定向分化的影響（誘導階段）；
　　2.胰島樣細胞通過免疫熒光染色檢測胰腺特異蛋白的表達；
　　3.通過實時定量PCR檢測胰島細胞相關(guān)基因的表達；
　　4.通過胰島素和胰高血糖素體外誘導釋放實驗初步評價胰島樣細胞體外釋放功能；
　　

6、5.通過糖尿病鼠腎被膜下移植胰島樣細胞來評價胰島樣細胞在體情況下對糖尿病鼠血糖及糖尿病癥狀的影響；移植8周后處死小鼠，取出移植側(cè)腎臟進行HE染色及免疫組織化學分析。
　　結(jié)果：
　　1.細胞經(jīng)一系列培養(yǎng)，第五階段LY294002誘導的胰島樣細胞數(shù)量減少，體積也較??；免疫熒光染色顯示：74.5%胰島樣細胞表達C肽，27.2%細胞表達胰高血糖素，31.3%細胞表達生長抑素，胰島素/生長抑素雙染陽性率僅3.5%，相較于Exendi

7、n-4誘導因子表達更低水平的胰高血糖素及生長抑素；
　　2.實時定量PCR結(jié)果顯示：LY294002組及TGX-221組相較于Exendin-4組胰島樣細胞表達更高水平的胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽，且NKX6.1、MAFA和GLUT2等胰島成熟相關(guān)因子基因表達也明顯升高；LY294002組與 TGX-221組胰島樣細胞表達的大部分胰腺內(nèi)分泌激素及成熟因子水平相似，但TGX-221誘導的胰島樣細胞的胰島素基因表達量是LY2

8、94002的近一倍，是Exendin-4誘導胰島樣細胞的176倍；
　　3.體外在高糖高鉀刺激下LY294002組胰島樣細胞釋放胰島素量、胰高血糖素量均是Exendin-4組的4倍，LY294002誘導的胰島樣細胞具有快速釋放胰島素及胰高血糖素功能，這和胰腺組織細胞的功能相似；
　　4.將LY294002誘導的胰島樣細胞移植到糖尿病模型鼠腎被膜下，一周后血糖開始下降并維持穩(wěn)定的血糖至8周，改善了糖尿病鼠的隨機血糖。另外，糖尿

9、病鼠多飲、多食、多尿、精神、毛發(fā)等糖尿病癥狀得到了改善。移植8周后處死小鼠，取出移植側(cè)腎臟進行組織學分析，蘇木精-伊紅染色顯示胰島樣細胞在移植側(cè)腎臟組織內(nèi)存活；免疫組織化學分析顯示，在小鼠腎臟邊緣及腎實質(zhì)內(nèi)存在呈棕紅染色的人胰島素陽性細胞；移植的細胞也無成瘤性。
　　結(jié)論:
　　1.在無血清培養(yǎng)基下通過添加外源性誘導因子 LY294002成功誘導人胚胎干細胞定向分化為更加成熟的胰島樣細胞，胰島素單染陽性率高，且在體外對高葡萄