肺炎克雷伯菌的毒力及其對視網膜色素上皮細胞炎癥相關因子表達的影響.pdf

1、目的:
　　眼內炎是一種兇險的感染性致盲性眼后段疾病，常常造成嚴重的視力損害，內源性眼內炎是一種眼外感染后經過血源性播散引起的兇險的感染性致盲性眼病，起病急驟，一旦病原菌侵入眼內，迅速破壞眼內組織，癥狀嚴重，雖然總體發(fā)病率低，但常造成嚴重的視力損害。細菌或真菌通過血液循環(huán)播散進入眼內，引起脈絡膜、視網膜、玻璃體等眼內組織的炎癥，其中細菌性眼內炎居多，患病的危險因素主要包括糖尿病、免疫抑制、靜脈導管滯留、長期使用抗生素等。在臨床上，

2、眼科醫(yī)師掌握內源性眼內炎的病原分布及其致病特點對于疾病的診斷、治療及預后改善至關重要。內源性眼內炎致病菌譜近年來不斷發(fā)生著變化，新興出現(xiàn)高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae，hvKP)引起的眼內炎，雖然最常見的癥狀亦是眼部腫脹、充血、視力模糊的突然發(fā)作，但其致病力明顯高于經典肺炎克雷伯菌(classic Klebsiella pneumonia，cKP)，更難治愈，視力恢復較差，預后

3、不良，本研究將高毒力肺炎克雷伯菌與經典肺炎克雷伯桿菌的特性進行比較，探討高毒力肺炎克雷伯菌毒力的相關特性及其對視網膜色素上皮細胞炎癥相關因子表達的影響。
　　方法:
　　收集8株高毒力肺炎克雷伯菌及8株經典肺炎克雷伯菌，分成高毒力肺炎克雷伯菌組和經典肺炎克雷伯菌組，首先分別檢測其高黏性特征、基因型特性、抗血清殺傷及抗巨噬細胞吞噬能力;再通過酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測細菌侵襲視網膜色素上皮細胞后炎癥細胞因子的表達水平，具體如下:

4、r>　　1.細菌毒力檢測:
　?、僬骋航z實驗:將受試菌接種于5％羊血瓊脂平板，于37℃孵育過夜，用細菌接種環(huán)向上挑起菌落，觀察記錄挑起的粘液絲長度;
　?、诨騬mpA(regulator ofmucoid phenotype gene A)檢測:提取細菌基因組DNA，按25uL反應體系和反應流程進行PCR反應擴增rmpA基因，檢測兩組細菌的基因表達情況;
　?、奂毦寡鍖嶒?培養(yǎng)至對數后期的細菌107CFU/L，與

5、血清按比例1∶1混合培養(yǎng)2h，將混合培養(yǎng)液梯度稀釋檢測細菌的存活數量，計算細菌的存活率;
　?、芗毦雇淌杉毎淌蓪嶒?將培養(yǎng)至對數后期的細菌107CFU/L，按感染復數(multiplicity of infection，MOI)100∶1比例與鼠源巨噬細胞Raw264.7混合孵育1h，檢測細菌存活數量，計算巨噬細胞內細菌的存活率。
　　2.酶聯(lián)免疫吸附實驗:兩組細菌分別感染視網膜色素上皮細胞10h，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗檢

6、測上清液中單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)及白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)兩種炎癥細胞因子產生的水平。
　　結果:
　　1.細菌毒力檢測:
　　①高毒力肺炎克雷伯菌組在粘液絲實驗中均表現(xiàn)為陽性，而經典肺炎克雷伯菌組均表現(xiàn)為陰性;
　　②rmpA基因檢測結果顯示:高毒力肺炎克雷伯菌組均有rmpA基因543BP的表達，而經典肺炎克

7、雷伯菌組沒有該基因的表達;
　?、奂毦寡鍖嶒灲Y果顯示:高毒力肺炎克雷伯菌組的存活率(18.2％)明顯高于經典肺炎克雷伯菌組的存活率(5.3％)，且差異有統(tǒng)計學意義(t=1.872，P＜0.05);
　　④細菌抗巨噬細胞吞噬實驗結果顯示:巨噬細胞胞內高毒力肺炎克雷伯菌組的細菌存活率(1.1％)明顯低于經典肺炎克雷伯菌組(7.5％)，存在統(tǒng)計學差異(t=5.434，P＜0.05)。
　　2.酶聯(lián)免疫吸附實驗:高毒力肺炎

8、克雷伯菌組感染視網膜色素上皮細胞后，細胞上清液中MCP-1(1177pg/mL)、IL-6(119pg/mL)均高表達，而經典肺炎克雷伯菌組MCP-1(670pg/mL)、IL-6(54pg/mL)則低表達，RPE細胞被高毒力肺炎克雷伯菌侵襲后分泌的MCP-1和IL-6的量分別是被經典肺炎克雷伯菌侵襲后的1.76倍和2.20倍，差異有統(tǒng)計學意義(tMCP-1=5.670，tIL-6=3.968，P均＜0.05)。
　　結論: