ICAM-1介導和NF-KB調控肝干細胞定向遷移的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景卵圓細胞(ovalcells,OVCs)為存在肝臟組織中的能自我復制并具有多向分化潛能的成體干細胞,它既可以長期增殖,又可以分化為成熟肝細胞和膽管細胞。Peterson等研究表明,OVCs能來源于骨髓中造血干細胞(hemopoieticstemcells,HSCs)。OVCs在肝細胞發(fā)育、生長、增生及癌變等生理和病理生理過程中起著重要作用。正常情況下肝臟細胞處于靜止期,分裂增殖緩慢,OVCs極少被檢測到。當肝臟受到嚴重損傷或肝細胞的

2、增殖受到抑制時,OVCs被激活,增殖,分化形成成熟肝細胞。肝臟嚴重損傷時,OVCs受自身狀態(tài)和微環(huán)境的調節(jié),分化為成熟肝細胞和膽管細胞,但其分化方向不一定固定不變,有研究表明,OVCs在特定的自身狀態(tài)和微環(huán)境的調節(jié)下,可以分化為肝癌細胞。另有研究發(fā)現(xiàn),肝損傷時,OVCs不僅出現(xiàn)在匯管區(qū),而且還存在于肝小葉內。匯管區(qū)的OVCs為什么會出現(xiàn)在肝小葉內?是什么使OVCs發(fā)生遷移?Sammons等人發(fā)現(xiàn),骨髓中原始造血干細胞表面存在一組以細胞間

3、粘附分子-1(Intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)為主的粘附分子,能介導HSCs與骨髓基質的粘附,從而使HSCs產生一種定向遷移的作用。慢性肝臟疾病或肝臟損傷時,肝組織中ICAM-1表達明顯增多。在對ICAM-1和原發(fā)性肝細胞癌(HCC)關系的研究中發(fā)現(xiàn),癌細胞ICAM-1呈強陽性表達,而正常肝細胞ICAM-1的表達為陰性。上述研究表明ICAM-1和HCC有著密切關系,但兩者之間具體是如何相互影

4、響的?ICAM-1在HCC的發(fā)生、發(fā)展過程中起著什么作用?對此我們還不清楚。我們設想,既然OVCs可以來源于HSCs,并且HSCs表達ICAM-1,那么OVCs也應表達ICAM-1;ICAM-1能介導HSCs與骨髓基質的粘附,從而使HSCs產生一種定向遷移的作用,那么ICAM-1是否也能介導OVCs與肝細胞間基質的粘附,并使OVCs定向遷移?本研究就是依據(jù)上述理論和設想而設計的,以探討ICAM-1在肝硬化和HCC發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

5、 目的建立肝損傷、OVCs增殖動物模型,觀察ICAM-1在肝損傷不同時期的分布;分離、純化OVCs,探討OVCs對ICAM-1的表達和NF-κB對ICAM-1表達的調控;并進一步探討ICAM-1和NF-κB在OVCs定向遷移中的作用,為臨床肝硬化和HCC的防治尋找新的途徑。 方法1、建立動物模型三周齡Wistar大鼠共64只,雌雄不限。常規(guī)飼養(yǎng)1周后,連續(xù)飼喂含0.06%致癌劑3'-甲基-4-二甲基偶氮苯(3'-Me-D

6、AB)飼料,正常飲水,擬建立肝損傷動物模型。分別在誘癌2、4、6、8、10、12周后各在戊巴比妥鈉腹腔麻醉下切取約0.5×0.5×0.2cm3大小肝組織標本于10%中性福爾馬林固定。同時,在4、6、8w取肝組織標本時另取1mm3大小的肝組織標本,于2%戊二醛固定,超薄切片,透射電鏡觀察。另取誘癌4周的大鼠行Percoll密度梯度離心法分離OVCs。 2、ICAM-1定位實驗取誘癌2、4、6、8、10、12周后損傷肝組織標本行以下

7、實驗: (1)常規(guī)病檢,觀察肝組織病理變化,重點觀察肝組織內OVCs的分布情況; (2)透射電鏡下觀察OVCs和周圍組織的生長情況; (3)對肝組織行ICAM-1免疫組化檢查,初步觀察ICAM-1在肝組織內的分布情況。 3、Procell梯度密度離心法分離、純化OVCs,對OVCs行ICAM-1免疫組化檢測,確切觀察ICAM-1在OVCs中的表達。 4、NF-κB對ICAM-1表達的調控將OVCs

8、分為A、B、C三組,A組為OVCs的單獨培養(yǎng),未加任何干預因素;B組加入NF-κB激活劑TNF-a干預;C組加入NF-κB抑制劑TGF-β1干預,每組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個亞組,于培養(yǎng)后第3、6、9、12天行以下實驗: (1)觀察在不同干預條件下單獨培養(yǎng)系內OVCs的生長情況,并計數(shù); (2)用RT-PCR技術對單獨培養(yǎng)系內的OVCs行ICAM-1mRNA半定量分析,觀察不同干預條件下OVCs對ICAM-1的表達情況;

9、 5、OVCs與Ito細胞的混合培養(yǎng),未加任何干預因素,光鏡下觀察混合培養(yǎng)系內的OVCs和Ito細胞粘附生長情況。 結果1、肝組織ICAM-1免疫組化顯示:肝損傷初期,ICAM-1主要分布在匯管區(qū),隨著肝損傷逐漸加重,ICAM-1表達增多,并向肝小葉擴散。這和相關報導的肝損傷時OVCs分布情況相吻合。 2、電鏡下見肝OVCs核大,核漿比高,核仁明顯,胞漿內細胞器少,僅見小的線粒體和少量內漿網,細胞呈幼稚、未分化狀態(tài);

10、 3、OVCsICAM-1免疫細胞化學檢測明顯陽性; 4、單獨培養(yǎng)系細胞計數(shù)顯示:與對照組比較,TNF-α促進OVCs的增殖,P<0.01,TGF-β1對OVCs的增殖能力無明顯影響,P>0.05; 5、RT-PCR技術對單獨培養(yǎng)系內的OVCs行ICAM-1mRNA半定量分析顯示:對照組、TNF-α組和TGF-β1組ICAM-1mRNA相對灰度值分別是0.480、0.752和0.403,TNF-α組ICAM-1m

11、RNA表達較對照組增強,而TGF-β1組ICAM-1mRNA表達較對照組減弱; 6、光鏡下連續(xù)觀察混合培養(yǎng)系內的OVCs和Ito細胞粘附生長情況顯示:混合培養(yǎng)第二天,OVCs向肝星狀細胞周圍聚集,第三天可見OVCs與肝星狀細胞明顯粘附生長。 結論1、在損傷肝組織標本中ICAM-1的分布與OVCs的分布一致; 2、在肝損傷肝組織中OVCs表達ICAM-1; 3、TNF-α和TGF-β1分別通過對NF-κB活

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