超順磁性氧化鐵促進大鼠脂肪源性干細胞成骨分化的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  1、探討超順磁性氧化鐵納米顆粒標記ADSCs后,對其增殖和活力造成的影響。
  2、SPIO標記ADSCs后,加入成骨分化誘導劑誘導ADSCs定向成骨分化,研究SPIO對ADSCs定向成骨分化所造成的影響。
  3、研究SPIO對ADSCs表達成骨相關基因造成的影響。
  方法:
  1、分離SD大鼠ADSCs,進行體外培養(yǎng)及傳代,倒置顯微鏡下動態(tài)觀察原代和傳代培養(yǎng)的ADSCs的生長形態(tài)、結構變

2、化及比較各代之間的差異。
  2、分別以CD34、CD44、CD45、CD90抗體標記ADSCs,使用流式細胞儀檢測分析其細胞免疫表型。
  3、將經(jīng)SPIO標記的ADSCs設為實驗組,無SPIO標記的ADSCs設為對照組,分別接種于24孔培養(yǎng)板中,接種密度為5×104個細胞/孔;使用手持式細胞計數(shù)儀在培養(yǎng)第1、2、3、4、5、6、7天分別對兩組細胞進行計數(shù),并描繪生長曲線圖。
  4、誘導ADSCs成骨分化:將實驗組

3、和對照組ADSCs接種子6孔板中,接種密度為3×104個細胞/孔;加入足夠的常規(guī)完全培養(yǎng)液,放在37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;當細胞融合至50%-70%時,小心吸去舊的培養(yǎng)液,每孔加入2ml的成骨分化誘導液培養(yǎng)基(含0.1μmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μmol/L抗壞血酸),每隔2-3天更換新鮮的成骨分化培養(yǎng)基,誘導分化2-4周。
  5、ALP活性測定:取成骨誘導培養(yǎng)7、14、21及28

4、d的兩組細胞,吸去培養(yǎng)液后PBS液清洗2次,加入1ml PBS液,收集細胞,使用超聲波細胞破碎儀裂解細胞,進行凍結→融化→凍結→融化操作,再以離心半徑10 cm、3000r/min離心10min;吸取上清液移到新的試管作為樣品。向培養(yǎng)板內添加100μl底物緩沖液和20μl樣品,震蕩器上充分振蕩1分鐘后,37℃下孵育15分鐘。添加80μl反應終止液,震蕩器上充分振蕩1分鐘,用酶標儀測量波長520nm處的吸光值OD值,并按試劑盒所提供的公式

5、計算各組ALP活性(金式單位/100 ml)。每組3個樣本。
  6、茜素紅染色法檢測細胞外基質礦化率:取成骨誘導分化培養(yǎng)7、14、21及28 d的兩組細胞爬片,吸去培養(yǎng)基,并用1×PBS洗3次,每次5min;加入2ml的4%中性甲醛固定4℃30分鐘;30分鐘后,吸去固定液,并用1×PBS漂洗3次,每次5 min;每孔加入1ml的0.1%茜素紅染液,37℃作用30 min;去除染色液,并用漂洗3次,每次5 min;自然干燥,中性樹

6、膠封片;置于倒置相差顯微鏡下觀察細胞外基質鈣鹽沉積情況、拍照。
  7、成骨細胞誘導形成率計算:成骨誘導分化培養(yǎng)7、14、21及28 d,使用甲醛固定細胞并用茜紅素進行鈣結節(jié)染色。在倒置顯微鏡下,兩組隨機取4個100倍視野,用數(shù)碼相機記錄。在計算機上將數(shù)碼照片放大至14cm×11cm,打印于70g復印紙上,仔細剪取孔底部分,準確稱其重量(S),再剪下茜紅素染色陽性結節(jié)部分,準確稱其重量(SI),即成骨細胞誘導形成率(%)=SI/S

7、×100%。
  8、流式細胞儀檢測細胞凋亡率:兩組細胞分別用1×Binding Buffer制成1×106細胞/ml的懸液,在5ml的培養(yǎng)管中加入100μl細胞懸液(約1×105個細胞);加入5~15μg純化的重組AnnexinⅤ;輕輕混勻,室溫反應15分鐘后每管加入5μlAnnexinⅤ-FITC和10μl PI;輕柔漩渦混勻,室溫避光處放置孵育15分鐘;各試驗管中再分別加入1×Binding Buffer400μl混勻后,室

8、溫避光5分鐘。1小時內上流式細胞儀測定結果。
  9、熒光定量RT-PCR檢測Runx2、Ocn、ALP和Opn基因轉錄水平:
  (1)總RNA的提取(Trizol抽提法)
 ?、偃φ战M和實驗組細胞接種于6孔板中,接種細胞量為1×105個細胞數(shù);進行成骨誘導分化實驗后,分別按設計的時間點收集細胞:day0、day7、day14;
  ②棄去培養(yǎng)基,用1×PBS清洗一次,每孔中加入1ml Trizol試劑,水平

9、放置片刻,使裂解液均勻分布于細胞表面并裂解細胞,用移液槍吸頭吹打細胞數(shù)次使細胞充分溶解,吸取勻漿轉移至1.Sml離心管中;
  ③加入200μl氯仿,蓋上管蓋,用力搖晃15s,在30℃下孵育2-3min,在2~8℃下以不超過12000×g的離心力高速冷凍離心15分鐘,使RNA分離;
  ④取一個不含RNA酶的1.5ml離心管,加入500μl異丙醇,將步驟3中的離心后上清液轉移到有異丙醇的1.5ml離心管中。用力搖晃混合均勻后

10、,在30℃條件下孵育10分鐘,然后在2~8℃下以不超過12000×g的離心力高速冷凍離心15分鐘;可見RNA形成一膠片狀沉淀附著于試管壁和管底;
 ?、菀迫ド锨鍛乙海尤?ml75%乙醇,翻轉離心管4-6次,旋渦振蕩混合樣品并在2-8℃下以不超過7500×g的離心力高速冷凍離心5min,洗脫RNA;
  (2) RNA逆轉錄合成第一鏈cDNA
 ?、賕DNA去除反應:將模板RNA置于冰上解凍,按FastQuant cD

11、NA第一鏈合成試劑盒說明書配制gDNA去除反應體系混合液;徹底混勻后離心,并置于42℃水中孵育3min,然后置于冰上放置。
  ②RNA反轉錄:按FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書配置反轉錄反應體系混合液;將反轉錄反應體系加到gDNA去除步驟的反應液中充分混勻,42℃孵育15min。再于95℃孵育3min后放置于冰上,得到的cDNA保存于-20℃用于后續(xù)實驗。
  10、統(tǒng)計學方法:計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((

12、x)±s)表示,樣本均數(shù)間的兩兩比較采用t檢驗,各組間比較采用單因素方差分析,應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學處理分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
  結果
  1、經(jīng)膠原酶消化法所收獲的原代SD大鼠ADSCs培養(yǎng)48h后細胞完全貼壁,細胞變?yōu)殚L梭形,較為扁平,呈成纖維樣細胞生長;原代細胞培養(yǎng)48小時候開始增殖,3~5d可達到增殖高峰,呈集落樣生長,在6~8d后達到80%左右融合。從第2代開始,細胞貼壁時間和增殖時

13、間較原代明顯加快.
  2、流式細胞儀檢測顯示,絕大部分SD大鼠ADSCs具有CD44+/CD90+/CD34-/CD44-的表型,表明ADSCs具有間充質干細胞免疫表型,但與造血干細胞系和血管生成干細胞系干細胞有區(qū)別。
  3、實驗組與對照組day1、day2、day3、day4、day5、day6、day7生長曲線均呈S型,第1-2天細胞增殖處于潛伏期,從第3天起細胞開始進入對數(shù)生長期。統(tǒng)計學分析表明:day2的細胞數(shù)量

14、在實驗組和對照組的差異無統(tǒng)計學意義;而day3、day4、day5、day6、day7的細胞數(shù)量在實驗組和對照組的差異有統(tǒng)計學意義,實驗組的細胞數(shù)量明顯多于對照組。說明標記SPIO后,ADSCs增殖能力不僅沒有受到抑制,反而有明顯增強。
  4、ALP在第7天時已具備明顯活力,到第21天時到達高峰,隨后維持高水平至第28天。自第7天起各個檢測點(誘導7、14、21、28d),實驗組與對照組ALP活性差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05

15、),提示標記SPIO后,ALP活性增加。
  5、成骨誘導分化7d時,實驗組ADSCs細胞外開始出現(xiàn)細小礦化結節(jié),并且隨著誘導時間延長,礦化結節(jié)增多、增大。誘導14d時,實驗組與對照組均形成明顯礦化結節(jié),28 d達高峰,細胞外有大量鈣結節(jié)出現(xiàn),但標記有SPIO的實驗組ADSCs礦化結節(jié)明顯增多、增大,結節(jié)中心有大量鈣鹽沉積。
  6、自第7天起,標記SPIO后,ADSCs成骨細胞誘導形成率在實驗組和對照組的差異有統(tǒng)計學意義,

16、實驗組明顯高于對照組,說明SPIO能促進ADSCs的成骨分化進程。
  結論:
  1、經(jīng)膠原酶消化法所收獲的SD大鼠原代ADSCs具有間充質干細胞免疫表型,增殖能力良好,傳代細胞生物學特性穩(wěn)定。
  2、標記SPIO后,能促進ADSCs增殖,不影響其細胞凋亡率,同時提高了ALP活性,增加了細胞外基質礦化結節(jié)形成率及成骨細胞誘導形成率。
  3、不論有無標記SPIO,使用間充質干細胞成骨分化誘導培養(yǎng)液,能將第三代

17、的ADSCs誘導為成骨細胞。
  4、SPIO能通過增強成骨相關基因Runx-2、Ocn、ALP和Opn的表達,促進ADSCs的成骨分化。
  5、本研究的不足之處:①應該進一步行普魯士蘭染色及透視電鏡檢測,以證實SPIO顆粒位于ADSCs細胞胞漿內及了解SPIO在細胞內分布情況,顯示共培養(yǎng)的可靠性。②需要進一步了解經(jīng)SPIO標記的ADSCs成骨分化后,使用免疫組化及蛋白免疫印跡方法檢測細胞內Runx-2、Ocn、ALP和O

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