人類靈長類特異鋅指蛋白ZNF480在肌生成中的作用.pdf

1、靈長類特異的KRAB鋅指基因約占人類基因組KRAB鋅指基因的30％。目前國際上有關靈長類特異鋅指基因的功能知之甚少。我們選擇鋅指基因ZNF480為模型研究靈長類特異鋅指蛋白的功能。
　　 ZNF480基因在肌肉和心臟組織中高表達,提示該基因可能與肌肉和心臟組織的發(fā)育有關。半定量RT-PCR和western blot實驗證明,在誘導的C2C12穩(wěn)定轉染細胞的肌分化過程中,ZNF480的mRNA和蛋白質水平持續(xù)上調,說明ZNF480

2、與肌分化過程密切相關。
　　 為了從形態(tài)上檢測ZNF480是否調控肌生成的過程,我們通過形態(tài)學和肌肉分化特異性抗體MHC對誘導分化的穩(wěn)定系細胞進行免疫熒光檢測。與載體過表達對照組比較,過表達ZNF480促進C2C12細胞形成更多的肌管和多核細胞,并且ZNF480穩(wěn)轉細胞的肌管和多核細胞隨著分化過程的進行而逐步增多。
　　 Myf-5,myogenin,MyoD是bHLH生肌調節(jié)因子,而E47,E12則是普遍表達的bHLH

3、蛋白。在肌分化過程中,MyoD和Myf5表達是決定多能性體節(jié)細胞定型為成肌細胞的關鍵步驟,myogenin在成肌細胞的終極分化中有重要作用。我們檢測了ZNF480是否對這些基因進行調控。半定量RT-PCR和western blot實驗證明,ZNF480能上調肌肉特異性bHLH轉錄因子和肌肉特異性基因MCK(肌肉激酶)的mRNA水平,以及MHC和myogenin的蛋白水平,說明ZNF480是通過調控bHZH和MCK促進肌分化。同時,ZNF

4、480過表達的C2C12穩(wěn)定系分化過程中,p21的蛋白水平明顯上調,說明ZNF480通過激活p21使細胞退出細胞周期而進入細胞分化。
　　 利用熒光素酶活性實驗,我們檢測到ZNF480在NIH3T3細胞中并不能促進E12或MyoD對MCK啟動子(MCK4800和4RTK)活性的調節(jié),但ZNF480能與E12/MyoD共轉時增強MCK啟動子的活性,說明ZNF480是通過與E12/MyoD協(xié)同調節(jié)MCK啟動子的活性。
　　

5、為了進一步檢測ZNF480是否結合到MCK和myogenin的啟動子上對其進行轉錄調控,我們利用EMSA實驗,證明了ZNF480不能直接結合到MCK啟動子上,但是能夠與E12/MyoD形成蛋白復合體結合到MCK的啟動子區(qū)域。同時,EMSA實驗證明ZNF480能夠直接結合到myogenin的啟動子區(qū)域。這些結果表明ZNF480通過形成蛋白復合體或直接結合的方式來調節(jié)MCK和myogenin的啟動子活性,從而參與肌肉分化的調控過程。