四個番茄果實成熟相關轉錄因子的功能研究.pdf

1、果實成熟是一個涉及到一系列的生理和生化變化的高度程序化調控的復雜的生物學過程。為了探索躍變型和非躍變型果實共有的成熟調控機理，可以將果實成熟分成乙烯調控部分和非乙烯調控部分。本研究分別從這兩個方面入手，采用轉基因超表達和沉默乙烯反應因子LeERF5，研究其對果實成熟的調控機理；同時利用基因芯片的方法，對番茄野生型AC++、番茄果實成熟突變體Cnr、rin和nor不同時期的果實進行表達分析。并通過信號途徑分析等信息學手段，篩選出在不同突變

2、體和果實不同時期之間存在表達差異的轉錄因子。通過分子生物學和植物生理生化等方法分析這些表達差異轉錄因子在果實成熟過程中的作用，從而建立果實成熟的信號網(wǎng)絡。
　　 本研究取得的主要結果如下：第一部分：乙烯反應因子LeERF5基因功能研究結果：
　　 在番茄野生型AC++中，LeERF5基因的相對表達量隨著果實的生長發(fā)育和成熟而下降，隨著葉片的生長發(fā)育和衰老而表達增強；傷害、干旱和復水、淹水、高溫和低溫、鹽脅迫、乙烯和ABA

3、均可以誘導LeERF5基因的表達。
　　 為了研究LeERF5的功能，利用CaMV的35S啟動子和終止子，構建了LeERF5基因超表達載體pBIN19-LeERF5。通過桿菌介導法將LeERF5基因轉入了番茄野生型AC++中。通過抗性篩選獲得了69個獨立轉化株系，即F501-F569。對其中的39個轉基因株系進行的Southern分析，發(fā)現(xiàn)在陽性LeERF5轉基因植株基因組中，轉基因拷貝數(shù)大部分為2-3個。僅有3個植株為單拷貝，

4、一個植株為4個拷貝。同時，Northern檢測結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)505等14株為LeERF5基因超標達植株，而另外的F501等14株轉基因植株為LeERF5基因的沉默植株。
　　 在LeERF5基因的超表達轉基因植株中，早期出現(xiàn)很明顯的側芽，而且側芽數(shù)在4個或者以上。后期比對照AC++植株矮小。LeERF5基因超表達植株沒有明顯的抗灰霉病和煙草花葉病毒的特性。以LePR-1，LePR-5，LePR-NP24的特異片段為探針進行。Nor

5、thern分析，結果顯示在轉LeERF5基因番茄株系和番茄野生型中這些基因的表達沒有明顯差異。但是，LeERF5基因超表達植株的葉片相對含水量高于WT，且在干旱時，其葉片中游離脯氨酸的含量明顯高于WT。LeERF5基因超表達株系與WT相比，抗旱性明顯獲得提高，耐鹽性獲得增強。
　　 因此，LeERF5基因的功能與番茄應對非生物因子的抗逆性密切相關。第二部分：番茄非乙烯信號途徑果實成熟相關轉錄因子的研究結果：
　　 通過A

6、ffymetrix基因芯片分析，并利用人工神經網(wǎng)絡分析方法，建立了番茄轉錄因子的人工神經網(wǎng)絡，并選取了其中的3個基因作為備選基因(基因3059、基因3948和基因93613)進行驗證研究。qPCR結果顯示，3個備選基因在番茄野生型AC++和番茄果實成熟突變體Cnr、rin中表達差異明顯，且三個基因之間的表達模式不同。利用Gateway的方法構建了基因3059的超表達載體以及基因3059、基因3948和基因93613的RNAi沉默載體。利

7、用農桿菌介導法獲得了轉基因植株，并通過qPCR的方法對轉基因植株的基因表達量進行了分析，分別獲得了基因3059的超表達轉基因植株、Co-suppression株系和RNAi株系；基因3948的RNAi株系；基因93613的RNAi株系。
　　 基因3059、基因3948和基因93613沉默株系的表型以及可視化VIGS結果與陽性對照PSY1基因相似，果實呈現(xiàn)近乎白化。而基因3059超表達株系的果實呈現(xiàn)出深綠色果實，Co-suppr

8、ession的果實與RNAi沉默株系果實相同，呈現(xiàn)近乎白化果實。且基因3059的RNAi和Co-suppression株系的花瓣出現(xiàn)了維管束白化的現(xiàn)象；而莖和果柄之間的離層也出現(xiàn)了顏色變化。
　　 基因3059的超表達可以使中果皮外層細胞的葉綠體數(shù)量增多且顏色加深，也可以使中果皮內層細胞的葉綠體顏色加深。其果實的葉綠素含量增加了3倍以上；而RNAi和Co-suppression植株果實葉綠素則下降了約30％。果實成熟后，基因30