TIGAR對鼻咽癌細胞自噬、凋亡及線粒體降解作用研究.pdf

1、目的：探討TIGAR(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator)基因沉默后對鼻咽癌5-8F細胞自噬、凋亡、線粒體降解及線粒體形態(tài)、功能的影響。
　　方法：1、體外培養(yǎng)鼻咽癌5-8F細胞系;通過慢病毒介導的特異性shRNA干擾TIGAR表達，并通過免疫熒光分析、Western blot檢測TIGAR在胞質及線粒體內表達水平變化;2、流式細胞儀分析沉默TIGAR基因后細胞內代謝產物

2、還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)及活性氧(ROS)含量變化，評估細胞內氧化應激水平;3、Western blot檢測主要的細胞自噬相關蛋白LC3、Beclin-1及P62表達水平變化，分析細胞自噬活性變化;4、JC-1染色細胞檢測線粒體膜電位變化;5、分離細胞質蛋白及線粒體蛋白通過Western blot檢測凋亡蛋白細胞色素c在線粒體與胞質內表達水平變化;流式分析檢測Annexin V/PI染色細胞凋亡率;6、Wes

3、tern blot檢測線粒體自噬蛋白PINK1及Parkin表達水平變化;線粒體綠色熒光探針標記線粒體，通過流式分析線粒體數(shù)量變化，Western blot驗證線粒體管家基因編碼的蛋白——mtHSP70表達水平變化，分析細胞內線粒體數(shù)量變化;7、電鏡下觀察細胞超微結構，特別是線粒體的形態(tài)結構變化;高效液相色譜法檢測細胞內ATP含量變化，評估線粒體功能。
　　結果：1、通過慢病毒介導的shRNA轉染5-8F細胞，成功構建TIGAR基

4、因沉默的細胞株(sh TIGAR)及對照組細胞株(sh scramble)，Western blot及免疫熒光分析均顯示在干擾組細胞胞質及線粒體內TIGAR表達水平明顯降低;2、TIGAR干擾導致細胞內NADPH產生減少，細胞內還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)比例降低，ROS水平明顯升高，細胞氧化還原狀態(tài)改變;3、干擾組細胞中自噬標志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1表達顯著上升，同時P62表達下降，表明細胞

5、自噬增強;4、沉默TIGAR引起細胞線粒體膜電位下降;5、干擾組細胞中細胞色素c在胞質內含量明顯增加而在線粒體內含量減少，且干擾組細胞凋亡率明顯升高，表明細胞凋亡增加;6、沉默TIGAR后，細胞胞質中PINK1水平上升，線粒體內Parkin表達增加，表明PINK1/Parkin途徑介導的線粒體自噬被激活，但干擾組細胞內線粒體數(shù)量卻較對照組細胞增多;7、電鏡下觀察到TIGAR干擾組細胞線粒體呈現(xiàn)出腫脹，脊瓦解，空泡形成的異常形態(tài)，同時高效

6、液相檢測顯示干擾組細胞內ATP生產較對照組細胞減少，表明線粒體的結構與功能完整性遭到破壞。
　　結論：沉默TIGAR后5-8F細胞內GSH/GSSG比例降低，ROS積聚，使細胞不能維持正常的氧化還原狀態(tài)，氧化應激增加，細胞自噬活性增強，細胞凋亡率上升，線粒體膜電位降低，線粒體膜通透性轉運孔(MPTP)開放，使PINK1/Parkin介導的線粒體自噬途徑被激活，但最終線粒體降解被阻礙，導致細胞內受損線粒體堆積，表現(xiàn)為線粒體結構紊亂及