脂聯素及其受體對血管內皮細胞一氧化氮合酶活性差異調節(jié)的分子機制研究.pdf

1、目的：
　　隨著心血管疾病所導致的病死率不斷增加，心血管系統(tǒng)疾病已經成為全球威脅人類健康的“全民公敵”。血管內皮具有內分泌和代謝功能，大量的研究證明，許多心血管疾病都有危險因子作用于血管內皮，進一步研究表明，內皮功能紊亂可由一氧化氮（NO）釋放減少或破壞增多等其他原因造成，其原因可能是精氨酸（Arg）缺乏、一氧化氮合酶（NOS）生成或磷酸化異常。內皮的正常功能破壞，可使血管收縮舒張調節(jié)介質、凝血系統(tǒng)因子、促生長介質之間的功能紊亂，

2、因此成為了心血管系統(tǒng)疾病一致的發(fā)生發(fā)展基礎[1]。
　　脂聯素（Adiponectin，APN）作為一種脂肪細胞因子，研究證明脂聯素具有加速脂肪酸氧化,促進糖轉運及降低肝糖輸出，對抗血管內皮炎癥反應，改善內皮依賴性血管舒張功能等作用[2]。此外,在冠心病及其他大血管病變中發(fā)現血漿脂聯素水平明顯降低,這提示脂聯素與心血管病變密切相關。大量的動物實驗證明，APN基因敲除（APN-/-）小鼠可導致嚴重的血管功能失調[3]，如對乙酰膽堿的

3、反應性舒張存在嚴重敏感性降低、血管內膜增厚等，這些癥狀給予APN之后可顯著改觀。但是，脂聯素對內皮舒張反應性調節(jié)的具體機制并不清楚；并且脂聯素及其受體如何調節(jié)其下游信號通路及機制也需進一步的研究證實。與此同時，有研究表明，窖蛋白1（Caveolin-1）存在腳手架結構，可與eNOS相互作用，從而改變NO的釋放，影響血管舒張功能。但是，脂聯素對血管舒張功能的調節(jié)與Caveolin-1是否有關，尚無定論。
　　為此本實驗設計如下：（1

4、）應用脂聯素及其受體基因敲除小鼠模型，觀察生理量脂聯素對其血管舒張功能的影響，以明確生理量APN對血管內皮功能的調節(jié)作用。（2）應用人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）觀察脂聯素如何通過脂聯素受體影響內皮功能。（3）探討脂聯素對其受體后信號NO生成及內皮一氧化氮合酶（eNOS）活性影響，進而解釋脂聯素對血管張力影響的機理。因而，本實驗的研究目的為：
　　1、明確APN對小鼠血管內皮功能的改善效應和對NO產生的影響；
　　2、探索

5、APN對HUVEC中eNOS的影響，進而揭示脂聯素I型和II型受體在eNOS活性調節(jié)中的作用；
　　3、探討Caveolin-1是否參與脂聯素受體誘導eNOS磷酸化過程，從而改善主動脈內皮功能。
　　方法：
　　1、選用6-8周齡正常C57BL野生型小鼠（WT），AdipoR1基因敲除小鼠（Adipo-R1KO），AdipoR2基因敲除小鼠（AdipoR2KO），Cav-1基因敲除小鼠（Cav-1KO），取其主動脈，以

6、生理量脂聯素（5μg/ml）孵育15 min，觀測脂聯素對內皮舒張功能， NO生成的影響；
　　2、原代培養(yǎng)HUVEC，并將培養(yǎng)的HUVEC分為5組：（1）對照組；（2）脂聯素組:脂聯素（終濃度為0，5，10和15μg/ml）作用0，15，30和60min；（3）脂聯素+AdipoR1 siRNA組:AdipoR1siRNA終濃度50nM，5μg/ml脂聯素作用15min；（4）脂聯素+AdipoR2 siRNA組： AdipoR

7、2 siRNA終濃度50nM，5μg/ml脂聯素作用15min；（5）脂聯素+Cav-1 siRNA組:Cav-1 siRNA終濃度50nM，5μg/ml脂聯素作用15min；
　　3、Western Blot技術測定各組HUVEC中eNOS和p-eNOS的蛋白表達量；
　　4、應用基因沉默技術分別將HUVECs中AdipoR1、AdipoR2及Cav-1基因沉默；
　　5、提取50μl細胞上清直接上NO檢測儀，以Na

8、NO2為標準品作標準曲線，化學發(fā)光法檢測總NOx含量。
　　結果：
　　1、生理量脂聯素能增加小鼠血管的內皮依賴性舒張效應，顯著改善血管內皮功能并且這種效應依賴于NO；
　　2、脂聯素處理AdipoR1基因敲除小鼠，主動脈對ACh的舒張反應顯著降低，脂聯素處理AdipoR2基因敲除小鼠，主動脈對ACh的舒張反應無明顯影響；
　　3、脂聯素對Cav-1KO小鼠的血管舒張反應降低；
　　4、不同濃度及時間脂聯素

9、對HUVECs一氧化氮合酶磷酸化（p-eNOS）的影響，5μg/ml脂聯素干預內皮細胞，eNOS磷酸化程度在15min時表達最高，NO生成水平也最高；
　　5、siRNA抑制AdipoR1的表達后，與AdipoR1未抑制組相比，脂聯素(5μg/ml)調節(jié)內皮細胞eNOS的磷酸化水平程度明顯降低，然而， AdipoR2 KD后，與AdipoR2未沉默組相比，脂聯素對內皮細胞eNOS的磷酸化程度無明顯變化；
　　6、 Caveo

10、lin-1 KD，顯著阻斷了脂聯素（5μg/ml）誘導的內皮細胞eNOS的磷酸化和NO的產生。
　　結論:
　　1、生理量APN通過增加NO的產生從而對小鼠血管內皮功能具有改善效應；
　　2、APN通過脂聯素I型受體增加eNOS的磷酸化水平及NO的分泌，而II型受體對脂聯素誘導eNOS及NO生成影響不顯著。在內皮細胞，I型II型受體在對脂聯素誘導的eNOS表達及活性調節(jié)中體現明顯的差異性；
　　3、Caveoli