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文檔簡介
1、目的:進一步證實蠶絲具有良好的生物相容性;觀察蠶絲的體內降解過程;探討鈣鹽溶解對蠶絲降解性的影響;比較微溶蠶絲、切割蠶絲與PGA在細胞黏附性方面的差異;探討用蠶絲作為組織工程支架體外構建軟骨的可行性。 方法:實驗分三個部分:第一部分蠶絲生物相容性及降解性研究,將脫膠后的蠶絲在CaCL.H2O(摩爾比1:8)溶液中按不同時間進行溶解,沉淀于直徑lOmm培養(yǎng)皿底部自然干燥呈圓盤狀,剪刀剪成數塊3×5mm2大小薄片。取實驗用昆明小鼠5
2、4只,隨機分為:cacl2處理20min組;cacl2處理60min組;未處理組,每組18只,每只小鼠背部皮下埋植3塊材料。埋植術后1月、2月、3月、4月、6月、8月,每組各處死小鼠2只,取出材料。埋植術后12月,處死剩余小鼠。行大體觀察、組織學切片觀察蠶絲的降解情況、降解產物對組織的影響及鈣鹽溶解對其降解性的影響。第二部分蠶絲與PGA的細胞黏附性比較研究,通過親水性測試及掃描電鏡觀察切割蠶絲性能及結構變化,取新生兔關節(jié)軟骨消化分離獲取
3、軟骨細胞,體外培養(yǎng)擴增,將傳至第3代細胞消化下來制成l×105/ml濃度單細胞懸液,以每孔105個細胞(1m1)分別接種子微溶蠶絲材料和切割蠶絲材料及PGA材料上培養(yǎng)24h,然后通過細胞計數法及MTT法作黏附細胞數檢測,評價黏附率。第三部分蠶絲復合兔關節(jié)軟骨細胞體外構建組織工程軟骨,選新生兔關節(jié)軟骨消化分離獲取的原代軟骨細胞為種子細胞,分別試用切割蠶絲及PGA為支架材料,采用體外培養(yǎng)4周構建組織工程軟骨。通過倒置相差顯微鏡、掃描電鏡、組
4、織學及免疫學檢測評價新生軟骨。 結果:第一部分蠶絲生物相容性及降解性研究結果:術后動物無不良反應,術區(qū)及鄰近皮膚無紅腫、水腫、破潰及異常隆起等。埋植術后1月、2月、3月、4月時可見材料表面包裹一薄層纖維結締組織,外形較植入時略有縮小。6個月時cacl2處理60min組發(fā)現(xiàn)1塊材料消失。8個月時cacl2處理20min組有1塊及caclz處理60min組有2塊材料消失。12個月時分別有7塊和9塊消失。以上結果提示蠶絲已降解可能。組
5、織病理學檢查可見,最初幾月各組均可見異物巨細胞排列于蠶絲周圍,隨月份增加逐漸減少,少見白細胞及淋巴細胞浸潤。體內埋植2月后多數切片均可見蠶絲有裂解現(xiàn)象,cacl2處理60min組較20min組出現(xiàn)早且明顯。6個月的組織切片中可以觀察到蠶絲局部結構消融現(xiàn)象。第二部分蠶絲與PGA的細胞黏附性比較研究結果:經過切割處理,蠶絲親水性明顯增加,掃描電鏡下可見經切割后蠶絲表面有更多的微絲剝脫,使得網孔增加、孔隙減小,絲與絲之間連接增加。細胞計數法測
6、得微溶蠶絲、切割蠶絲及PGA三種材料黏附率分別為67.3%、84.2%、77.8%,MTT法測得三種材料黏附率分別為68.3%、83.3%、77%。各組數據經方差分析,微溶蠶絲組與切割蠶絲組有統(tǒng)計學差異,切割蠶絲組與PGA組無統(tǒng)計學差異。第三部分蠶絲復合兔關節(jié)軟骨細胞體外構建組織工程軟骨研究結果:倒置相差顯微鏡下見軟骨細胞接種24h后單個或成團吸附在支架纖維表面或密布于纖維孔隙中。培養(yǎng)5天時,可見大部分纖維上均有細胞纏繞,纖維增粗。培養(yǎng)
7、1周時外觀有所增大,復合物密不透光。復合物培養(yǎng)2周時掃描電鏡下觀察,可見細胞呈多角狀伸展開來,胞外基質分泌旺盛,黏附并包繞蠶絲纖維,成片狀沉積覆蓋于材料表面并進入支架內部。體外培養(yǎng)4周后,進行組織學檢測,可見蠶絲構建的組織工程化軟骨組織能形成近似于正常軟骨的結構。免疫組化檢測可見蠶絲構建的軟骨組織中有被染成棕黃色的II型膠原。 結論:(1)天然蠶絲具有良好的生物相容性,脫去絲膠后埋植皮下1月后少見急性炎癥細胞浸潤。(2)蠶絲體內
8、1年左右可以降解,降解產物不產生炎癥反應。(3)經過鈣鹽溶解處理后降解時間加快,溶解20分鐘與60分鐘在降解率方面比較無統(tǒng)計學差異,而20分鐘微溶解對蠶絲結構性能影響較小,更適合用作組織工程支架材料。(4)切割蠶絲具有良好的親水性和細胞黏附性,細胞黏附率較未切割組相比較有統(tǒng)計學差異;和PGA相比無統(tǒng)計學差異(5)切割蠶絲纖維制作的支架能夠維持軟骨細胞立體培養(yǎng)的三維環(huán)境條件??紫洞笮∵m中,利于細胞進入材料內部。(6)軟骨細胞在蠶絲支架上生
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