嗜酸乳桿菌對重型顱腦損傷小鼠腸道平滑肌鈣依賴性通路影響的研究.pdf

1、腸動力不足(Intestinal motility deficiency，IMD)是重型顱腦損傷(Severe head injury,SHI)后常見的并發(fā)癥。如果不能在早期進行有效的防治，可引起腸道菌群紊亂、加重機體炎癥反應，甚至誘發(fā)多器官功能障礙綜合征。目前臨床用于防治IMD的藥物均存在一定的副作用。近年來，益生菌在危重癥患者治療中的作用受到關注。研究表明，益生菌不僅能糾正嚴重創(chuàng)傷患者的腸道菌群失調，還具有改善腸動力的作用。但迄今大

2、多數(shù)研究僅觀察了用益生菌后的效果，對其改善腸動力相關機制的研究較少。平滑肌細胞的收縮舒張是腸動力的最終效應器，而鈣依賴性通路是調控平滑肌細胞收縮的重要通路。當細胞受到外界刺激時胞外Ca2+可經(jīng)細胞膜上的Cav1.2鈣離子通道流入細胞內，同時胞內鈣庫也會通過肌質網(wǎng)膜上的IP3R、RyR3釋放部分Ca2+，使胞內游離的Ca2+濃度升高，Ca2+與CaM、MLCK形成Ca2+/CaM/MLCK復合物，最終使MLC20磷酸化，引起平滑肌收縮。由

3、此可見，MLC20的磷酸化水平與平滑肌細胞的收縮有密切的關系。此外，研究還發(fā)現(xiàn)PKC在調節(jié)MLC20磷酸化水平及腸道平滑肌收縮中也至關重要。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌可改善SHI小鼠腸道平滑肌的收縮功能，本研究在此基礎上采用SHI小鼠腸動力不足模型，以調節(jié)腸道平滑肌收縮的鈣依賴性通路為切入點，分別在給SHI小鼠灌胃嗜酸乳桿菌1d、3d、7d后觀察其腸道平滑肌鈣依賴性通路中信號分子的變化，初步揭示嗜酸乳桿菌改善SHI小鼠腸動力不足的可能

4、機制。本課題旨在為嗜酸乳桿菌用于創(chuàng)傷領域提供實驗證據(jù)，同時對探討益生菌改善腸動力的相關機制提供參考依據(jù)。
　　目的:觀察SHI后小鼠腸道平滑肌鈣依賴性通路信號分子的表達變化，明確嗜酸乳桿菌對傷后小鼠腸道平滑肌鈣依賴性通路的影響，初步揭示嗜酸乳桿菌改善SHI小鼠腸動力不足的分子機制。
　　方法:本研究將90只健康雄性C57BL/6小鼠(18-24g)隨機分為假傷組、損傷組和損傷+嗜酸乳桿菌組（每組30只）。每組小鼠均分為1d、

5、3d、7d三個時相點（每一時相點10只小鼠）。各組小鼠均用5％的水合氯醛進行腹腔麻醉。損傷組和損傷+嗜酸乳桿菌組均采用改良的Feeney's自由落體撞擊法建立SHI后腸動力不足小鼠模型。假傷組只開骨窗，不進行打擊。傷后約4h待小鼠清醒后開始灌胃。假傷組及損傷組小鼠灌胃0.5ml嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基溶液，損傷+嗜酸乳桿菌組灌胃相同體積的嗜酸乳桿菌混懸液（約含菌1×1010CFU）。每天灌胃一次，其余時間均自由飲食水。分別在傷后1d、3d、7d

6、留取末端回腸（距盲腸1.5cm）。蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測20KDa肌球蛋白輕鏈(MLC20)的磷酸化水平。酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)及免疫組織化學染色技術檢測肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的表達量，ELISA檢測MLCK的活性。ELISA檢測PKC蛋白水平、L型鈣離子通道Cav1.2、三磷酸肌醇受體(IP3R)、雷諾定受體(RyR3)的表達量。
　　結果:1.MLC20磷酸化水平變化
　　W

7、estern blotting結果:與假傷組相比較，MLC20在SHI后1d、3d、7d的磷酸化水平均明顯降低（損傷組 vs假傷組，1d，3d，7d:P＜0.05）;嗜酸乳桿菌灌胃1d、3d、7d后SHI小鼠腸道平滑肌MLC20的磷酸化水平顯著升高(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組，1d，3d，7d: P＜0.05)。
　　2.MLCK表達量及活性變化
　　ELISA及免疫組化結果:MLCK在SHI后1d、3d、7d的蛋白濃度均

8、明顯低于假傷組（損傷組vs假傷組，1d，3d，7d:P＜0.05）;嗜酸乳桿菌干預1d、3d、7d后MLCK的濃度均顯著高于損傷組（損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組，1d，3d，7d:P＜0.01）。同時，傷后1d、3d、7d的MLCK活性均低于相同時相點假傷組MLCK的活性（損傷組vs假傷組，1d，3d，7d:P＜0.01）;嗜酸乳桿菌干預1d、3d和7d后MLCK的活性顯著增強，且與損傷組相比差異有統(tǒng)計學意義(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷

9、組，1d，3d，7d:P＜0.05)。
　　3.PKC蛋白水平變化
　　ELISA結果:SHI后1d、3d、7d的PKC水平明顯高于假傷組相同時間點PKC的水平(損傷組vs假傷組，1d，3d，7d: P＜0.05);嗜酸乳桿菌灌胃1d、3d、7d后SHI小鼠腸道平滑肌PKC水平顯著降低(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組，1d，3d，7d:P＜0.05)。
　　4.Cav1.2表達量變化
　　ELISA結果:SHI后第

10、1d及損傷3d和7d后，小鼠腸道平滑肌Cav1.2的表達量均明顯降低（損傷組vs假傷組，1d，3d，7d，P＜0.01）;嗜酸乳桿菌干預1d、3d和7d后Cav1.2的表達量均顯著高于損傷組(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組，1d，3d，7d: P＜0.01)。
　　5.IP3R表達量變化
　　ELISA結果:IP3R在SHI后第1d及傷后3d和7d的表達量均明顯低于相同時相點假傷組IP3R的表達量（損傷組vs假傷組，1d，3d

11、，7d，P＜0.01）;IP3R在嗜酸乳桿菌灌胃1d后的表達量雖有升高，但與損傷組相比差異無統(tǒng)計學意義(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組，1d:P＞0.05)，嗜酸乳桿菌灌胃3d和7d后SHI小鼠腸道平滑肌IP3R表達量顯著提高（損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組，3d，7d: P＜0.01）。
　　6.RyR3表達量變化
　　ELISA結果:SHI后1d、3d、7d的RyR3表達水平均顯著降低（損傷組vs假傷組，1d，3d，7d，P

12、＜0.01）;嗜酸乳桿菌灌胃第1d及灌胃3d和7d后RyR3蛋白水平均有升高，但與損傷組相比差異均沒有統(tǒng)計學意義(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組，1d，3d,7d: P＞0.05)。
　　結論:1.SHI后小鼠腸道平滑肌鈣依賴性通路信號分子的表達水平發(fā)生異常變化。
　　2.SHI后小鼠腸道平滑肌鈣依賴性通路中MLC20的磷酸化水平降低，MLCK的活性減弱、表達量下降。嗜酸乳桿菌可增強傷后MLCK的活性、提高MLCK的表達量及M