新基因BRAP的克隆與功能研究.pdf

1、神經(jīng)肽在氣道高反應或氣道炎癥發(fā)生過程中的作用越來越引起重視。蛙皮素樣肽(bombesin-like peptides BLPs)是一類具有廣泛生物學功能的神經(jīng)肽。在哺乳動物，目前已經(jīng)確認的BLPs成員有胃泌素釋放肽(GRP)和神經(jīng)介素B(NMB)。與之對應，哺乳動物體內(nèi)BLPs受體家族已確認3個成員，分別是GRP受體、NMB受體和蛙皮素受體亞型-3(bombesin receptor subtype3，BRS-3)。前二者分別與GRP和

2、NMB以高親和力結(jié)合并引起相應生物學功能，而BRS-3的天然配體尚未確定，故屬孤兒受體，蛙皮素受體亞型-3是由399個氨基酸組成的7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，在正常的大多數(shù)組織內(nèi)表達很低，其生物學意義、生物學效應、基因表達調(diào)控目前不太清楚，而在發(fā)育中的肺組織及腫瘤組織中表達增高，提示BRS-3可能與細胞生長、損傷修復有關。本研究發(fā)現(xiàn)，BRS-3在肺和氣道上皮應激反應調(diào)節(jié)過程中可能發(fā)揮作用，并進一步對BRS-3的生物學功能、基因表達調(diào)控和BR

3、S-3天然配體進行了一系列研究。細菌雙雜交技術顯示BRS-3可與多種蛋白發(fā)生相互作用，這些蛋白的功能分別與細胞的生長、分化、抗凋亡、細胞骨架、酪氨酸激酶等有關。免疫共沉淀同時發(fā)現(xiàn)兩種可與BRS-3發(fā)生相互作用的新蛋白，其生物學意義不清楚。本研究針對其中一種與BRS-3相互作用的新基因（暫命名蛙皮素受體激活蛋白bombesin receptor activated protein BRAP，基因庫序列號：NM-152734）的序列特征、生

4、物信息學及其功能進行相關研究。
　　 目的：利用生物信息學技術，搜索克隆基因及預測基因功能等方法研究與蛙皮素受體亞型-3(Bombesin receptor subtype-3,BRS-3)相互作用的一個新基因BRAP的基本生物信息學特征，進一步觀察BRAP表達蛋白的細胞亞定位以及在支氣管上皮細胞中的功能，為研究BRAP與BRS-3在支氣管上皮細胞應激反應中的超分子組裝奠定基礎。
　　 方法：⑴利用克隆基因分析軟件對BR

5、AP進行生物信息學分析。⑵利用RT-PCR擴增新基因BRAP的ORF，并克隆至pEGFP-C1載體，構建真核重組質(zhì)粒pEGFP-C1/BRAP，轉(zhuǎn)染Hela細胞，同時以空白細胞和空載體轉(zhuǎn)染細胞作對照，經(jīng)瞬時高效表達，在激光共聚焦顯微鏡下觀察其表達產(chǎn)物的亞細胞定位。以Western-blot法分析轉(zhuǎn)染后蛋白表達情況。⑶構建真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(＋)/BRAP，瞬時轉(zhuǎn)染人的支氣管上皮細胞(Human bronchial epithe

6、lial cells,HBECs)，流式細胞儀檢測其對細胞周期的影響；篩選穩(wěn)定表達pcDNA3.1(＋)/BRAP HBEs株，觀察BRAP新基因?qū)χ夤苌掀ぜ毎麚p傷修復的影響。損傷修復測定采用在融合的支氣管上皮細胞單層上造成一小面積不規(guī)則缺損，用顯微視頻分析系統(tǒng)每隔4h測量缺損面積一次，繪制時間與修復面積的直線回歸方程，直線的斜率的絕對值為損傷修復指數(shù)，斜率越大，損傷修復速度越快。
　　 結(jié)果：①BRAP cDNA全長6721

7、bp，編碼354個氨基酸，精確定位于6p21.2，并在正常胎兒腦組織、胎肺、胎肝、人胚干細胞、腦星形細胞瘤、前列腺癌、肺癌等組織中高表達，蛋白結(jié)構預測顯示該基因有跨膜區(qū)域。②構建真核重組質(zhì)粒pEGFP-C1/BRAP，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序證實與GENE BANK數(shù)據(jù)庫的序列一致，熒光標記蛋白亞細胞定位結(jié)果顯示其表達產(chǎn)物定位于胞膜和胞漿，在轉(zhuǎn)染重組子的細胞中其蛋白的表達明顯上調(diào)。③構建真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(＋)/BRAP

8、，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序證實與GENE BANK數(shù)據(jù)庫的序列一致；流式結(jié)果提示重組質(zhì)粒pcDNA3.1(＋)/BRAP對細胞周期的S期＋G2提高25％；并促進了HBECs的損傷修復的能力。
　　 結(jié)論：⑴生物信息學分析結(jié)果提示提示BRAP具有信號分子特性，可能參與細胞生理功能的調(diào)控。⑵該基因表達蛋白亞細胞定位于胞膜和胞漿，提示該蛋白可能是胞漿蛋白，參與細胞信號轉(zhuǎn)導。⑶BRAP在HBECs高表達后促進HBECs細胞分裂周期