磷酸甘露糖異構酶基因表達載體的構建及植物遺傳轉化正篩選系統(tǒng)的建立.pdf

1、根據GENBANK數據庫中大腸桿菌(Escheriachiacoli)的磷酸甘露糖異構酶基因(phosphomannoseisomerasePMI)序列設計引物，通過PCR的方法得到約1200bp片段并與克隆載體pGM-Teasy連接，經測序證明與已發(fā)表PMI序列同源性達到100％。將其作為選擇基因，構建到植物表達載體pBI-121上，得到可以在含有甘露糖的培養(yǎng)基上篩選的pBI-PMI、pBI-NPTII-PMI及pBI-k88-PMI

2、的表達載體。通過對普通煙草(NicotianatabacumL.)、番茄(LycopersiconesculentumMill.)、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)和甜瓜(CucumismelonL.)(伽師瓜)的甘露糖敏感性測驗結果發(fā)現(xiàn)：普通煙草和紫花苜蓿不能用此轉化系統(tǒng)進行篩選。甜瓜(伽師瓜)和番茄LIGEER87-5可以用并得到較適合的篩選培養(yǎng)基：甘露糖濃度分別是19％和8％。以甜瓜(伽師瓜)(Cucumismelon

3、L.)，番茄(LycopersiconescμlentumMill.)LIGEER87-5為受體材料，通過根癌農桿菌EHAl05(pBI-PMI、pBI-NPTII-PMI及pBI-k88-PMI)介導進行轉化，獲得了一批經甘露糖篩選后的甜瓜和番茄芽，且這些分化芽能夠在含有甘露糖培養(yǎng)基上生長。通過氯酚紅(CPR)法對轉基因甜瓜葉片的磷酸甘露糖異構酶做了定性分析，進一步證明成功建立了以PMI為標記基因的選擇系統(tǒng)。實驗結果表明，此轉化系統(tǒng)可

4、以用于轉基因甜瓜和轉基因番茄的篩選。 實驗一PMI基因的克隆及植物表達載體的構建摘要：根據GENBANK數據庫中大腸桿菌的磷酸甘露糖異構酶基因(phosphomannoseisomerase，PMI)序列設計引物，通過PCR的方法得到約1200bp片段并與克隆載體pGM-Teasy連接，經測序證明與公布的PMI序列同源性達到100％。通過內切酶消化、連接等方法進一步構建了含有不同標記基因及目的基因的植物表達載體pBI-PMI、p