滾環(huán)擴增技術在DNA甲基化檢測芯片及高通量DNA測序技術中的應用研究.pdf

1、DNA芯片是通過將大量不同的DNA靶分子按照已知順序固定在固相基片（多數采用玻片）上組成密集的微陣列（Microarray）或陣列(Array)，利用核酸雜交原理對靶核酸進行檢測分析。滾環(huán)擴增技術(Rolling circle amplification，RCA)是一種恒溫擴增技術，在DNA、RNA、SNP、細胞原位檢測、全基因組擴增方面有較多的應用。異常的DNA甲基化與癌癥及許多其他疾病的發(fā)生密切相關，發(fā)展高通量和高特異性的DNA甲基

2、化檢測芯片具有重要的臨床應用價值。本論文以滾環(huán)擴增技術為主，發(fā)展了多種基因組DNA甲基化檢測的新的DNA芯片檢測方法。本論文還針對新一代DNA測序技術中的高密度DNA文庫制備問題，采用滾環(huán)擴增技術和在片原位鏈替代方法獲得了可用于測序的基因組片段芯片。還進一步地把高密度磁珠微陣列技術和微流體芯片技術相結合，發(fā)展了一種高密度磁珠的微流體DNA測序芯片。
　　 具體內容包括：
　　 1、基于分枝滾環(huán)擴增(HRCA)技術的特定C

3、pG位點的甲基化檢測芯片。
　　 針對包含酶切位點的特定CpG位點，提出并實現(xiàn)了一套新的基于分枝滾環(huán)擴增原理的樣本處理方案。設計一個鎖式探針與目標DNA序列在CpG位點雜交，并通過甲基化敏感性內切酶和連結酶對鎖式探針與目標DNA同時進行酶切和連結。當CpG位點處于甲基化狀態(tài)，鎖式探針能成功地被連接酶環(huán)化，成為HRCA反應的環(huán)狀模板。連結形成的環(huán)狀模板與HRCA反應所需的兩個引物雜交后啟動HRCA擴增。將一個引物末端進行丙烯酰胺修

4、飾，可以使HRCA產物固定在丙烯酰胺基片上形成3-維膠基DNA微陣列。通過與CY3標記的探針雜交，即可檢測CpG位點的甲基化狀態(tài)。利用這個方法，我們成功地對位于P15，E-cadherin，hMLHl和MGMT基因上的四個CpG位點的甲基化狀態(tài)進行分析。實驗結果得到甲基化特異性PCR驗證。研究表明，該方法快速便捷，可用于高通量定性分析基因組DNA中特定CpG位點的甲基化。
　　 2、基于滾環(huán)擴增(RCA)技術的CpG島甲基化的定

5、量檢測芯片。
　　 為了識別目的基因中的甲基化和未甲基化的CpG位點，樣品DNA首先用亞硫酸氫鹽處理。目標區(qū)域通過PCR擴增后，未甲基化的CpG二核苷轉化成TpG；同時甲基化的CpG得到保留。設計一對鎖式探針，其中一條與CpG位點匹配，另一條與TpG匹配。鎖式探針對與純化的PCR產物雜交，當鎖式探針的兩個末端與PCR產物匹配時，鎖式探針才能被連結，并形成RCA反應所需的環(huán)狀模版。這樣，通過我們設計的一對鎖式探針，把原目標基因中C

6、pG位點甲基化狀態(tài)的信息用對應的環(huán)狀模版所表述出來，并在下一步的RCA反應中被放大。連結的鎖式探針與RCA通用引物雜交后，在Φ29DNA聚合酶作用下，通過RCA反應進行擴增。RCA產物固定在玻片上形成DNA微陣列。DNA微陣列與通用的CY3-CY5雙色探針對進行雜交。而這兩種通用探針分別針對甲基化和非甲基化而設計的，通過雜交產生的兩種熒光強度的比值可以用來檢測樣本中的甲基化狀態(tài)。利用這個方法，我們成功地對位于P16和IGFBP7基因上的

7、CpG島的甲基化狀態(tài)進行了定量分析，實驗結果得到甲基化特異性PCR驗證。實驗結果表明，這種RCA產物微陣列有望用于CpG島的甲基化狀態(tài)的定量分析。
　　 3、利用滾環(huán)擴增和在片原位鏈替代擴增來平行展示基因組片段。
　　 高通量測序技術，要求在一個芯片大小的面積上，同時進行上百萬個大規(guī)模平行的測序反應以獲得極高的測序通量。因此只有將上百萬個待測基因組DNA片段平行地展示于芯片，形成高密度的DNA測序芯片，才能滿足這種高通量

8、測序的要求。我們利用Φ29 DNA聚合酶進行兩步擴增從而在玻片上產生大量的DNA克隆群落，這些克隆群落可以實現(xiàn)基因組DNA片段在玻片上的平行展示。本研究中，在φ29 DNA聚合酶作用下，基因組DNA片段先以RCA的方式在液相中擴增，然后再以鏈替代反應的方式在玻片上進一步擴增。利用這個方法產生的DNA克隆群落成功地實現(xiàn)了T7基因組片段在玻片上的平行展示。這些DNA克隆群落可以成功地用雜交或熒光-dNTP進行識別，被展示的DNA片段和背景熒

9、光信號有明顯的區(qū)別。本方案有較好的重現(xiàn)性，用本方案產生的DNA克隆群落有望用于高通量測序。
　　 4、利用微流體技術和磁珠陣列制作高密度測序芯片。
　　 通過磁珠乳液PCR可以制備出表面帶大量DNA片段克隆的磁珠，這種克隆磁珠已經成功用于制備高密度測序芯片。但現(xiàn)行方案制備的磁珠測序芯片用于高通量測序時，在測序過程中對試劑的消耗量非常大。我們設計了微流體芯片，并將帶有DNA片段克隆的磁珠以共價結合的方式，固定于微流道中形成