單唾液酸四己糖神經節(jié)苷脂體外定向誘導人臍帶間充質干細胞分化為神經樣細胞及其機制的研究.pdf

1、目的:分離并培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞，鑒定細胞表型，在體外用單唾液酸四己糖神經節(jié)苷脂(GM1)誘導人臍帶間充質干細胞分化為神經樣細胞并探索其最佳誘導濃度。
　　方法:獲取新生兒臍帶，剔除臍動、靜脈，將間質組織剪成微小組織塊，用膠原酶消化后將臍帶組織置于含有胎牛血清、營養(yǎng)因子、青鏈霉素混合液的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，原代細胞12小時后全量換液，24小時后半量換液，之后每3天換液一次，每次換液時用倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況，貼壁情況，

2、計數(shù)細胞生長密度，并拍照記錄。當觀察到培養(yǎng)瓶中的細胞呈放射狀生長，或排列成漩渦狀時，加入胎牛血清終止消化，用胰蛋白酶消化后，按照1∶2或1∶3的比例傳代，記為P1。依次類推，記為P2，P3。繪制細胞生長曲線。
　　取培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的P3，P5，P10代細胞作細胞，用胰酶消化，用PBS緩沖液漂洗后重懸為單細胞懸浮液，細胞計數(shù)板計數(shù)細胞密度，以大于105個的量平均分裝于10個EP管中，滴加單克隆抗體CD73、CD90和CD105、

3、CD19、CD34、CD45、CD11b和組織相容性抗原HLA-DR(MHC-Ⅱ)，用抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC單克隆抗體作為同型對照。
　　擴增后，取第3代細胞，分為A、B、C、D、E5組，前4組為實驗組，E組為對照組，實驗組各組GM1濃度分別為:A組50μg/mL、B組100μg/mL、C組150μg/mL、D組200μg/mL，誘導液用L-DMEM培養(yǎng)基配制，對照組只含L-DMEM培養(yǎng)基。觀察5組誘導液誘導hUM

4、SCs的神經分化的作用，每間隔1h觀察誘導后細胞的形態(tài)變化，于第6h用免疫細胞化學染色方法檢測神經元特異性標記物微管結合蛋白-2(MAP-2)、神經絲蛋白(NF-H)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達情況，并計算陽性細胞比率，結果以(X)±s表示。
　　結果:可以從臍帶中分離并培養(yǎng)間充質干細胞，原代培養(yǎng)的細胞在12h內大部分細胞能貼壁，細胞呈菱形、多邊形，之后逐漸變?yōu)殚L梭形細胞快速生長，并能穩(wěn)定的傳代，至第10代仍能保持旺盛的增

5、殖能力。當細胞培養(yǎng)至第7天時細胞呈放射狀、旋渦狀生長，并可見細胞因生長密度過大造成脫落。
　　用流式細胞技術進行的細胞表型鑒定顯示P3、P5和P10代細胞均表達間充質干細胞表面標記物CD73、CD90和CD105，而不表達造血干細胞標記物CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR，證明所培養(yǎng)的細胞為間充質干細胞。
　　誘導后1h，實驗組各組均可見部分細胞胞體收縮為橢圓狀，兩端伸出突起，呈紡錘樣，以D組神經樣細胞數(shù)

6、量最多，A組最少;第2、3h各組神經樣細胞數(shù)量逐漸增加，突起伸長，以D組比率最高;第4h時，A、B、C組神經樣細胞數(shù)繼續(xù)增加，表現(xiàn)為雙極或多極細胞，以雙極細胞為主，D組神經樣細胞開始脫落，比率不再增加;第5h時，A、B組神經樣細胞增加不明顯，可見部分細胞脫落，C組神經樣細胞數(shù)目最多，也伴隨少量細胞脫落，D組神經樣細胞呈片狀脫落，比率明顯下降;第6h時，A、B組神經樣細胞不再增加，C組神經樣細胞未見明顯變化，D組視野內僅見少量未脫落的神經

7、樣細胞;E組誘導前后細胞形態(tài)未見明顯變化。
　　誘導至第6小時，免疫細胞化學染色顯示實驗組各組神經樣細胞成熟神經細胞標記物微管結合蛋白-2(MAP-2)、神經絲蛋白(NF-H)呈陽性表達，而膠質細胞標志物膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達陰性，150μg/mL組細胞的MAP-2、NF-H陽性表達率最高。對照組誘導前后無明顯變化。
　　結論:人臍帶間充質干細胞可以從臍帶組織中分離出來并可以穩(wěn)定的傳代，并表達間充質干細胞表面標志，