矮牽牛PMADS9，PMADS1和CHSJ基因片段克隆及hpRNAi載體構建.pdf

1、RNA干擾(RNAi)是一種新發(fā)現(xiàn)的通過dsRNA介導的特異同源靶基因抑制途徑。因RNAi基因沉默具有高效、特異和簡捷等優(yōu)點，為細胞內(nèi)基因表達研究提供了新思路、新方法，從而使其具有廣闊的應用前景。近年來RNAi引起的PTGS逐步被用于基因功能的研究，并且在植物的抗病毒及品質遺傳改良中的應用也得到了長足的發(fā)展。 以往對植物基因進行轉錄后沉默的手段有反義識別和共抑制兩種。但是，通過這兩種手段僅能得到有限數(shù)目的沉默個體植株。2001年

2、，S.Varsha Wesley等人通過對一種能過自我滿足配對的發(fā)夾結構的RNA(hpRNA)的研究證實了此種結構可有效提高基因沉默效率。利用這種在正義臂及反義臂結構之間存在一個內(nèi)含子結構的載體可更加有效的提高基因沉默的效率。從而比反義識別及共抑制在對基因功能的研究上更加有效。 MADS-box基因是指含有保守的DNA結合域MADS盒的轉錄調(diào)控因子，它們廣泛存在于真核生物界。是一類重要調(diào)節(jié)基因，在植物發(fā)育(尤其是花器官發(fā)育以及

3、同源異型轉換中)過程中扮演者十分重要的角色。分離并研究MADS-box基因，將有助于探明植物生殖發(fā)育的分子模式，并為觀賞植物和花卉品種的基因工程改良奠定基礎。 PMADS9是最近在觀賞花卉矮牽牛中發(fā)現(xiàn)的AGL15亞家族基因，其功能尚未報道。本實驗通過PCR技術從矮牽牛幼蕾cDNA中克隆出PMADS9，PMADS1和CHSJ基因，分別構建了hpRNAi植物表達載體，并利用農(nóng)桿菌介導法分別將三個基因導入矮牽牛。主要實驗結果如下：

4、 1.矮牽牛PMADS9基因片段的克隆與表達載體構建 以矮牽牛(Petunia hybrida)基因組DNA為模板，通過設計兩對分別添加不同酶切位點的特異引物，利用PCR技術擴增獲得PMADS9基因片段。PMADS9基因片段序列與已公布序列(GenBank登錄號：AY370526)中相應片段完全一致，構建了hpRNi植物表達載體pDH-1。 2.矮牽牛PMADS1基因片段的克隆與表達載體構建 以矮牽牛(Pe

5、tunia hybrida)幼蕾cDNA為模板，通過設計兩對分別添加不同酶切位點的特異引物，利用PCR技術擴增獲得PMADS1基因片段。序列分析表明，PMADS1基因片段序列與已公布序列(GenBank登錄號：X14599)比對，所擴增片段與之完全一致。構建了hpRNAi植物表達載體pDH-2。 3.矮牽牛CHSJ基<片段的克隆與表達載體構建 以矮牽牛(Petunia hybrida)幼蕾cDNA為模板，通過設計兩對分別