狼毒及其制劑的化學成分分析及代謝產物和蛋白結合率的研究.pdf

1、狼毒為瑞香科植物瑞香狼毒Stellera chamaejasme L.、大戟科植物月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata或狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.的干燥根，廣泛分布于我國東北、華北、西南等地區(qū)。狼毒有大毒，臨床上用于治療炎癥、水腫、皮膚病、結核和腫瘤等疾病。
　　目前，對于狼毒的研究主要集中于某一類或幾種化學成分的提取、分離，而對其藥材及制劑中多組分的同時分析及體

2、內代謝研究報道較少。本研究建立了微波輔助提取-UPLC-Q-TOF-MS/MS法鑒定瑞香狼毒中的化學成分，總結其質譜裂解規(guī)律，為全面研究瑞香狼毒的化學組成和質量控制奠定了基礎；采用UPLC-Q-TOF-MS/MS法對東莨菪內酯在大鼠尿液和膽汁中的代謝產物進行鑒定，為東莨菪內酯的臨床應用提供重要參考；建立新型中空纖維離心超濾（HFCF-UF）技術聯合 HPLC法測定3種香豆素類成分的蛋白結合率，為治療藥物監(jiān)測中蛋白結合率的研究提供有效手段

3、；建立微波輔助提取-離子液體分散液液微萃取-高效液相色譜法測定狼毒制劑結核靈片中6種組分的含量，為全面控制結核靈片的質量提供新的手段。
　　第一部分微波輔助提取-UPLC-Q-TOF-MS/MS法鑒定瑞香狼毒中的化學成分
　　目的：建立微波輔助提取-UPLC-Q-TOF-MS/MS法鑒定瑞香狼毒藥材中的化學成分，并對其質譜裂解規(guī)律進行總結。
　　方法：采用電噴霧離子源，在正、負離子模式下分別對對照品和供試品溶液進行一級

4、和二級質譜掃描，總結對照品的質譜裂解規(guī)律。應用“Peak View2.0”軟件中的“Master View”功能對瑞香狼毒供試品溶液的譜圖進行分析，通過保留時間、質譜裂解特征并參照文獻進行瑞香狼毒中化合物結構的推測、鑒定。色譜條件：采用C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm）；流動相：A為含0.1％甲酸的水溶液，B為乙腈；梯度洗脫；柱溫25°C；流速0.3 mL/min；進樣量2μL。
　　結果：共鑒定了瑞香狼毒中3

5、7種化合物（其中香豆素類10種，黃酮類25種，其它類2種），并對其可能的裂解途徑進行推測，總結質譜裂解規(guī)律。
　　結論：該方法簡便、快速，為全面研究瑞香狼毒的化學組成和質量控制奠定了基礎，為中藥材的定性鑒別提供有效手段。
　　第二部分 UPLC-Q-TOF-MS/MS法鑒定東莨菪內酯在大鼠尿液和膽汁中的代謝產物
　　目的：建立UPLC-Q-TOF-MS/MS法鑒定東莨菪內酯在大鼠尿液和膽汁中的代謝產物，探索東莨菪內酯在

6、體內的主要代謝途徑。
　　方法：采用電噴霧離子源，正離子模式監(jiān)測。色譜柱：C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm，）；柱溫：25°C；流動相：水（含0.1%的甲酸）-乙腈（含0.1%的甲酸）；梯度洗脫；流速：0.3 mL/min；進樣體積：5μL。SD大鼠灌胃東莨菪內酯對照品后，分別收集0~72 h尿液和0~24 h膽汁，與空白生物樣品平行制備樣品并進樣測定，應用Metabolite Pilot1.5數據處理軟件進行

7、東莨菪內酯代謝物的分析、鑒定。
　　結果：鑒定出東莨菪內酯在大鼠體內可能的代謝產物7個，其中，尿液中代謝物7個、膽汁中3個，主要代謝途徑為去甲基化、羥基化、水解反應、葡萄糖醛酸化和硫酸酯化。
　　結論：該方法專屬性強、靈敏度高，為東莨菪內酯體內代謝過程的研究以及新的活性成分的發(fā)現提供了有效手段。
　　第三部分中空纖維離心超濾-高效液相色譜法測定3種香豆素類成分的蛋白結合率
　　目的：建立新型中空纖維離心超濾（HF

8、CF-UF）技術聯合 HPLC法測定3種香豆素類成分（巖白菜素、瑞香素和東莨菪內酯）的蛋白結合率。
　　方法：將中空纖維切成長度為15 cm的小段，分別用甲醇和超純水超聲清洗5s以除去雜質，室溫晾干備用。將中空纖維彎成U型置于離心超濾玻璃管中，組成HFCF-UF裝置。取空白血漿900μL于1.5 mL離心管中，加入混合對照品溶液100μL，渦旋混合30 s，將其置于37°C水浴中預平衡30 min。取預平衡溶液400μL置于HFC

9、F-UF裝置中，將中空纖維兩端用封口膜固定，于10000 rpm離心10 min，取出中空纖維，用注射器推出中空纖維內腔中的超濾液，注入HPLC儀，用于待測組分游離濃度的測定。同時另外取預平衡溶液400μL置于HFCF-UF裝置中，加入丙酮150μL，渦旋混合30 s后進行HFCF-UF，用于待測組分總濃度的測定。根據藥物游離濃度和總濃度計算蛋白結合率。分析方法采用Diamonsil C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；

10、流動相為甲醇：1%乙酸（pH=3.0）=35:65；流速1.0 mL/min；進樣體積20μL；檢測波長327 nm；柱溫為室溫。
　　結果：3種香豆素類成分與血漿中的內源性物質實現了良好分離。各待測組分線性關系良好，相關系數r>0.9996，日內精密度和日間精密度的RSD值分別小于3.3%和3.2%，相對回收率為97.6%~101.0%，絕對回收率為97.5%~100.9%。高、中、低3個濃度水平的QC樣品分別經歷室溫放置24

11、h、-80°C凍存14天和3次凍融（-80°C放置24 h后解凍）循環(huán)后進樣測定的RSD值分別小于4.3%、4.4%和4.4%。
　　結論：本研究建立了一種新型HFCF-UF-HPLC法測定3種香豆素類成分的蛋白結合率。該方法通過向血漿樣品中加入丙酮作為蛋白結合釋放劑使藥物從藥物-蛋白復合物中釋放出來從而測定藥物總濃度，進而實現藥物游離濃度和總濃度的平行制備與測定。與傳統(tǒng)的蛋白結合率的測定方法比較，該方法不需要復雜的樣品預處理過程

12、而只需要簡單的離心即可進樣測定，藥物的蛋白結合平衡不被破壞，方法簡單、靈密度高、回收率和重現性好。該方法的建立也為治療藥物監(jiān)測中同時測定藥物游離濃度、總濃度和蛋白結合率提供了有效手段。
　　第四部分微波輔助提取-離子液體分散液液微萃取-高效液相色譜法測定結核靈片中6種組分的含量
　　目的：建立簡便、新穎、高效的微波輔助提取-離子液體分散液液微萃取結合HPLC法測定結核靈片中6種組分（瑞香素、東莨菪內酯、傘型花內酯、西瑞香素、

13、異茴芹內酯和狼毒乙素）的含量。
　　方法：采用微波輔助提取-離子液體分散液液微萃取方法制備供試品溶液。分析方法采用Kromasil C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇（A）和四氫呋喃：1%HAc=1:40, pH3.0（B），梯度洗脫；檢測波長325 nm；流速1.0 mL/min；進樣體積20μL；柱溫為室溫。
　　結果：6種待測組分與供試品中其它干擾組分實現了良好分離。各組分的峰面積與濃度線

14、性關系良好，相關系數r大于0.9993。日內精密度和日間精密度的 RSD值分別小于4.9%和4.9%。加樣回收率范圍為96.0%~103.8%，RSD小于4.0%。瑞香素、東莨菪內酯、傘型花內酯、西瑞香素、異茴芹內酯和狼毒乙素的富集倍數分別為43、47、43、41、42和45倍。
　　結論：該方法簡單、經濟、方便、環(huán)保、靈敏度高、溶劑消耗少、分析時間短、富集效率高。該方法的建立為結核靈片的質量控制提供了有效的手段，為中藥材及其制劑