巖藻糖基轉移酶在肺腺癌中的臨床意義及功能研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  蛋白質糖基化是一種重要的翻譯后修飾,并對蛋白質的功能和結構有重要的影響。巖藻糖基轉移酶家族在多種腫瘤中表達異常,但其在肺癌中的表達情況及其作用機制尚不清楚。本實驗在前期收集臨床組織標本的基礎上,篩選肺癌組織中特異表達的巖藻糖基轉移酶,并構建FUT2低表達肺腺癌A549細胞株,觀察FUT2的表達變化對A549細胞生物學功能的影響,為肺腺癌檢測診斷及其分子靶向治療提供新的方法和理論依據(jù)。
  方法:
  第一部

2、分:
  (1)Trizol法提取了肺癌新鮮配對組織的mRNA,逆轉錄為cDNA后,用實時熒光定量PCR(SYBR Green法)分別檢測FUT2(22例)/FUT4(10例)/FUT7(19例)/FUT8(16例)的mRNA在癌組織和鄰近正常組織中的表達。
  (2)用Western Blot分析肺癌新鮮配對組織中FUT2/FUT8蛋白表達水平。用Image J軟件對目的蛋白FUT2(21例)/FUT8(13例)及內參Tu

3、bulin/GAPDH蛋白進行相對定量,分析FUT2/FUT8蛋白的表達情況。
  (3)用HE染色法對收集到的4對肺腺癌配對組織切片進行染色,確定標本的正確性;并采用SABC免疫組化法檢測FUT2/FUT8的蛋白表達情況。
  第二部分:
  (1)把FUT2的RNA干擾質粒載體和對照無義序列載體用脂質體穩(wěn)定轉染進肺腺癌A549細胞株,并采用G418抗生素篩選出轉染陽性細胞單克隆。
  (2)分別采用實時熒光定

4、量PCR(SYBR Green法)檢測目的基因mRNA表達、Western Blot檢測目的蛋白的表達,衡量FUT2 shRNA干擾效果。
  (3)CCK-8法檢測FUT2干擾后對A549細胞增殖能力的影響,實時熒光定量PCR(SYBR Green法)檢測細胞周期蛋白CyclinD1基因水平表達情況。
  (4)劃痕實驗和Transwell小室法檢測FUT2對細胞遷移能力的影響。
  (5)實時熒光定量PCR(SYB

5、R Green法)和Westem Blot實驗檢測相關粘附因子E-cadherin、β-catenin的基因和蛋白水平表達情況,并運用免疫熒光技術在激光共聚焦顯微鏡下觀察β-catenin蛋白在FUT2穩(wěn)定干擾A549細胞內的分布情況。
  (6)Western Blot實驗檢測基質金屬蛋白酶家族MMP2/MMP9的蛋白表達的變化。
  (7)實時熒光定量PCR(SYBR Green法)和Western Blot實驗檢測凋亡

6、因子BCL-2基因和蛋白水平表達情況。
  結果:
  1.在肺癌標本中,F(xiàn)UT7 mRNA在癌組織表達有所降低,F(xiàn)UT8 mRNA表達有所升高。在肺腺癌標本中,F(xiàn)UT2/FUT8 mRNA呈高表達趨勢;
  2.在肺癌標本、肺腺癌標本中FUT2/FUT8蛋白水平都呈高表達趨勢;
  3.經HE染色確診的肺腺癌組織標本切片中FUT2/FUT8蛋白水平都呈高表達趨勢;
  4.FUT2干擾質粒載體已成功轉入肺

7、腺癌A549細胞并得到穩(wěn)定表達的細胞株;
  5.FUT2干擾后能抑制A549細胞的增殖能力,CyclinD1 mRNA表達降低;
  6.FUT2低表達細胞遷移能力有所降低;
  7.FUT2低表達細胞中E-cadherin mRNA和蛋白表達上調;β-catenin mRNA表達明顯上調,其總蛋白水平無明顯趨勢;β-catenin在肺腺癌A549細胞膜上積聚,表達量有所升高;
  8.基質金屬蛋白酶家族MMP

8、2/MMP9的蛋白水平表達降低;
  9.FUT2干擾后抗凋亡因子BCL-2基因水平明顯下調,而蛋白水平有所降低但無統(tǒng)計學意義。
  結論:
  本研究通過臨床組織標本中特異性巖藻糖基轉移酶的篩選,發(fā)現(xiàn)FUT2/FUT8在肺癌及肺腺癌中呈現(xiàn)高表達趨勢;同時成功構建FUT2靶向干擾肺腺癌A549細胞株的穩(wěn)定轉染模型。綜合所有實驗結果分析表明,下調FUT2的表達,肺腺癌A549細胞的無限增殖和遷移侵襲能力受到抑制,并對細胞

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