利用特定轉(zhuǎn)錄因子的mRNAs誘導(dǎo)小鼠體細(xì)胞重編成為多能狀態(tài)的研究.pdf

1、細(xì)胞分化是一個(gè)由少數(shù)特化細(xì)胞變?yōu)橐粋€(gè)完全分化的細(xì)胞類型的發(fā)育生物學(xué)過(guò)程。在多細(xì)胞生物的發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞分化使得生物由一個(gè)簡(jiǎn)單的合子變?yōu)榫哂袕?fù)雜細(xì)胞類型和組織的系統(tǒng)。細(xì)胞分化過(guò)程是一個(gè)龐大的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括一些進(jìn)化保守的分子過(guò)程，比如細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與調(diào)控分化相關(guān)基因的開關(guān)。盡管目前已有眾多關(guān)于細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)機(jī)制的研究，但對(duì)于發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞分化和特異化的機(jī)制尚不明確。為了解決之一問(wèn)題，將已分化的細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為多能性細(xì)胞，進(jìn)而探討細(xì)胞的分化機(jī)

2、制就顯得尤為必要。
　　長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，大部分學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞在分化過(guò)程中會(huì)失去不再需要的染色體或永久可滅活的基因，因此這些分化的體細(xì)胞命運(yùn)無(wú)法重新編程。但是，細(xì)胞融合、體細(xì)胞核移植等實(shí)驗(yàn)方法以及提取的所有細(xì)胞表明細(xì)胞的命運(yùn)可以被逆轉(zhuǎn)并具有胚胎時(shí)期的特性，這暗示可溶性的反式作用因子在細(xì)胞中的存在，且可以賦予細(xì)胞從一個(gè)狀態(tài)轉(zhuǎn)變到另一個(gè)狀態(tài)的能力，通過(guò)發(fā)現(xiàn)和識(shí)別，這些因子被認(rèn)定主導(dǎo)細(xì)胞特化和分化作用。這就表明在細(xì)胞分化過(guò)程中起重要作用的是可逆

3、的表觀遺傳變化，而非不可逆的基因變化。對(duì)基因重編程的不同理解為進(jìn)一步探索在發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞分化機(jī)制提供了新的方法和途徑。
　　目前利用體細(xì)胞重編程產(chǎn)生多能性細(xì)胞已取得很大成就，為進(jìn)一步了解分化和去分化機(jī)制提供幫助，并在科學(xué)和醫(yī)學(xué)上領(lǐng)域能夠取代ES細(xì)胞以克服非倫理限制。此外，細(xì)胞重編程獲得的多能性細(xì)胞在醫(yī)療過(guò)程避免了免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)樗鼇?lái)自于患者自身的細(xì)胞。而且，它能夠參與到組織工程、再生醫(yī)學(xué)細(xì)胞替代療法和藥物開發(fā)。
　　目前

4、通過(guò)體細(xì)胞核移入卵母細(xì)胞(SCNT)以及體細(xì)胞和多能性細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合的方法能夠使細(xì)胞進(jìn)行重編程而具有多能性。最近通過(guò)病毒介導(dǎo)特定轉(zhuǎn)錄因子(TFs)異位表達(dá)也具有同樣的功效。自此，由于病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因在操作過(guò)程中的危險(xiǎn)，以及轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)的方法因DNA序列集成的限制可導(dǎo)致原癌基因表達(dá)導(dǎo)致惡性腫瘤和不良后果，所以該方法一直在不斷的改進(jìn)。盡管把以非整合DNA為基礎(chǔ)的方法如:腺病毒，仙臺(tái)病毒或空病毒法作為質(zhì)粒、小環(huán)狀和非整合型附著載體的使用，DNA

5、的集成問(wèn)題還是難以避免。故而，通過(guò)DNA轉(zhuǎn)染的方式讓相關(guān)蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞中表達(dá)使得體外多能性的誘導(dǎo)成為可能。但是，這一方法仍然面臨眾多問(wèn)題:成本高，效率低以及無(wú)法完全了解轉(zhuǎn)入細(xì)胞中蛋白質(zhì)的具體功能。而且，在非整合重編程獲得多能性細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)和microRNAs轉(zhuǎn)染與多能性有關(guān)聯(lián)，但是具體機(jī)制尚不明確。
　　最近，科學(xué)家使用一種更加安全的重編程方法:通過(guò)導(dǎo)入編碼重編程因子的mRNA分子進(jìn)入體細(xì)胞（mRNA介導(dǎo)的基因傳

6、遞）。這種方法在造血干細(xì)胞、充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和來(lái)源于神經(jīng)元中的星形膠質(zhì)細(xì)胞中使用能夠高效的促進(jìn)蛋白表達(dá);并且成纖維細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞被重編程為心肌細(xì)胞。目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)證實(shí)，在人類體細(xì)胞成編程產(chǎn)生多能性性細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染的體細(xì)胞多能性基因被成功激活。依賴相關(guān)因子易位表達(dá)的重編程與主要的基因，表觀遺傳修飾相結(jié)合能夠克服重編程過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄障礙。
　　鑒于利用重編程因子mRNA來(lái)誘導(dǎo)小鼠的多能性的相關(guān)報(bào)道較少，我們?cè)谑褂胢

7、RNA轉(zhuǎn)染方法的基礎(chǔ)上，旨在將小鼠成纖維細(xì)胞去分化或重編程，逆向回到其多能性特性細(xì)胞的發(fā)育階段。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)成果，首先我們克隆與多能性相關(guān)的基因或因子的全序列，插入T7啟動(dòng)子下游，構(gòu)建真核表達(dá)載體。其次，包含因子的新型重組載體用于體外合成mRNA，轉(zhuǎn)染至受體成纖維細(xì)胞中，目的是重編程具有胚胎干細(xì)胞特性，通過(guò)特異的形態(tài)學(xué)、分子和功能分析檢測(cè)這些重編程獲得的細(xì)胞的特性。最后，探索重編程機(jī)制，通過(guò)在重編程過(guò)程中跟蹤其表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化變化

8、，我們檢測(cè)了一些多能性標(biāo)記的遺傳和表觀遺傳變化以及表觀遺傳分子的影響。本研究為更好的理解重編程過(guò)程調(diào)節(jié)提供基礎(chǔ)，并且有助于發(fā)現(xiàn)早期胚胎發(fā)育機(jī)制。
　　本研究結(jié)果包括以下幾點(diǎn):
　　1.根據(jù)Gnen Bank公布的四個(gè)多能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4，Sox2，c-Myc，和K1f4(OSCK)的序列并克隆。從鼠的睪丸、小腸和結(jié)腸等組織中反轉(zhuǎn)錄(RTPCR)獲得OSCK的開放閱讀框或編碼區(qū)(CDS)。結(jié)果顯示，OSCK的CDS長(zhǎng)度分別為

9、1059 bp，960 bp，1320 bp和1452bp。NCBI BLAST測(cè)序結(jié)果顯示，每一個(gè)基因都與屬的參考序列具有高序列同源，Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4分別為100％，100％，100％和99％。這些說(shuō)明克隆的四個(gè)基因序列正確。
　　2.通過(guò)體外克隆真核表達(dá)載體下游到T7啟動(dòng)子的開放閱讀框(ORF)來(lái)構(gòu)建體外轉(zhuǎn)錄模板并且在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過(guò)程中在5'端加帽子，在3'端加poly(A)尾巴。合成的mRNA通過(guò)陽(yáng)離

10、子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染第二天RT-PCR檢測(cè)到mRNA的高表達(dá)。間接免疫熒光染色表明該mRNA表達(dá)的蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)。
　　3.通過(guò)流式細(xì)胞(FACS)分選轉(zhuǎn)染編碼GFP的mRNA的細(xì)胞，我們優(yōu)化的轉(zhuǎn)染體系為每1×105 MEF最適mRNA量為1ug，并且檢測(cè)出持續(xù)幾天均具有高表達(dá)，隨后由于mRNA和蛋白的降解而降低，結(jié)果說(shuō)明了需要幾次重復(fù)轉(zhuǎn)染mRNA來(lái)保持蛋白的長(zhǎng)時(shí)間高水平表達(dá)，這對(duì)于細(xì)胞重編程來(lái)說(shuō)是必需的。

11、經(jīng)過(guò)五次連續(xù)轉(zhuǎn)染，觀察到成纖維細(xì)胞的間充質(zhì)表面出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變化，呈現(xiàn)緊湊的上皮細(xì)胞的形狀，且在轉(zhuǎn)染期間不斷增加直到在重編程的第8天出現(xiàn)類似克隆的結(jié)構(gòu)，隨著時(shí)間變化，在第15天，克隆數(shù)量達(dá)到100-130個(gè)，尺寸上逐漸增大，呈現(xiàn)明顯的邊緣，具有高的核質(zhì)比。新生的類ES克隆呈現(xiàn)AKP陽(yáng)性，通過(guò)RT-PCR或免疫染色技術(shù)顯示表達(dá)ES細(xì)胞特異性標(biāo)記基因。新轉(zhuǎn)變的細(xì)胞同樣也顯示出與ESC相近的啟動(dòng)子甲基化模式以及體內(nèi)和體外分化為三個(gè)主要發(fā)育的胚層

12、的能力，免疫染色顯示胚層特異性標(biāo)記物顯示陽(yáng)性;βⅢ微管蛋白（外胚層），平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)（中胚層）以及Sox17(內(nèi)胚層)。在體內(nèi)，畸胎瘤形成包含所有三個(gè)胚層的組織，包括軟骨、肌肉、脂肪（中胚層），色素上皮組織（外胚層）以及上皮組織（內(nèi)胚層）。因此，當(dāng)轉(zhuǎn)染鼠特異合成mRNA，鼠多能性基因的激活和誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞的產(chǎn)生可以通過(guò)一個(gè)安全的方式獲得。
　　4.在此期間，通過(guò)檢測(cè)的一些多能性標(biāo)志物的表達(dá)水平與啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，本研

13、究檢測(cè)了在重編程期過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)變化。上皮基因如E-鈣粘蛋白(CDH1)持續(xù)上調(diào)伴隨，間葉細(xì)胞基因如Snail和Thy1持續(xù)下調(diào)，并伴隨間質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞的過(guò)渡過(guò)程中的形態(tài)變化。轉(zhuǎn)染和非轉(zhuǎn)染多能性基因的表達(dá):在轉(zhuǎn)染期間（第一個(gè)6天）表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子(OSCK)顯著上調(diào)，轉(zhuǎn)染停止后這些因子有一段時(shí)間的下調(diào)。我們的研究揭示了當(dāng)大部分轉(zhuǎn)錄因子降解過(guò)程中，在第12天開始產(chǎn)生了第二次的基因上調(diào)，原因可能是由于這些因子的內(nèi)源性基因被激活。一旦在實(shí)