腸易激綜合征腸上皮-腸膠質細胞網絡調控異常的分子機制研究.pdf

1、目的：
　　本研究分三個部分對以上問題進行探討，第一部分研究IBS患者結腸BDNF過表達可能的起始機制，第二、三部分探討腸粘膜BDNF過表達介導IBS腹痛發(fā)生的分子機制，
　　方法：
　　第一部分依據(jù)功能性胃腸病羅馬Ⅲ標準連續(xù)納入22例IBS-D患者和17例正常對照者，收集每位受試者新鮮糞便，經處理后提取上清液(Fecal supernatants，F(xiàn)SN)，應用azo-casein法測定上清液蛋白水解酶活力。應用絲氨

2、酸蛋白酶抑制劑驗證IBS-DFSN升高的蛋白酶活性依是否賴于絲氨酸蛋白酶。
　　FSN分別刺激6小時和24小時提取細胞總RNA，應用實時熒光定量PCR檢測BDNF和PAR-2 mRNA表達;同時收集細胞培養(yǎng)液上清，應用ELISA測定上清BDNF濃度。
　　選用野生雄性C57BL/6小鼠，應用IBS-D FSN結腸灌注誘導小鼠結腸高敏感。
　　第二部分根據(jù)羅馬Ⅲ標準入選IBS患者和正常對照者，每位IBS患者完成一份腸道功

3、能評分量表，進行腹痛嚴重程度和頻率評分。收取IBS和正常對照者糞便，提取上清。
　　應用免疫組織化學檢測活檢標本結腸粘膜中BDNF和GFAP表達，熒光雙標檢測TrkB受體和P物質在EGC和腸神經纖維中的表達。
　　應用透射電鏡觀察EGC形態(tài)學改變，并定量EGC中異染色質，線粒體，糖原顆粒，高爾基體和核糖體數(shù)目的改變。
　　第三部分應用IBS-D患者糞便上清以及BDNF+/-C57BL/6小鼠和同窩出生BDNF+/+野生

4、小鼠構建模擬IBS的內臟高敏感模型。收集灌注部位結腸組織，應用western blotting和免疫組織化學和免疫熒光染色檢測結腸粘膜BDNF，GFAP，TrkB和SP的表達。
　　應用大鼠空腸腸系膜神經放電實驗檢測EGC培養(yǎng)液上清和r-HuBDNF對腸系膜傳入神經興奮性放電和機械敏感性的影響，進一步驗證EGC激活和BDNF對腸道感覺傳入神經興奮性和敏感性的直接作用。
　　結果：
　　第一部分
　　1.IBS-D

5、患者糞便上清液中絲氨酸蛋白酶活性明顯升高。
　　2.IBS-D患者糞便上清誘導Caco-2細胞BDNF mRNA和蛋白表達升高Caco-2細胞BDNF mRNA表達在IBS-D FSN刺激后顯著升高。而FUT-175預處理的IBS-D FSN組BDNF mRNA表達明顯受到抑制。與mRNA結果一致，ELISA檢測BDNF蛋白表達在IBS-D FSN刺激后同樣顯著升高，F(xiàn)UT-175則同樣明顯抑制IBS-D FSN對BDNF蛋白表達

6、的誘導作用。
　　3.PAR-2基因沉默顯著抑制IBS-D糞便上清對Caco-2細胞BDNF表達的誘導作用
　　PAR-2受體在IBS-D FSN刺激后表達顯著高于對照FSN組，為進一步探討PAR-2受體激活是否參與IBS-D FSN對BDNF表達的誘導過程，我們應用脂質體介導RNA干擾瞬時沉默PAR-2基因在Caco-2的表達。結果顯示PAR-2基因沉默對Caco-2 BDNF的基礎表達無明顯影響，但卻顯著抑制IBS-D

7、FSN對Caco-2細胞BDNF表達的上調作用。
　　4.p38 MAPK通路蛋白參與IBS-D糞便上清液誘導的Caco-2細胞BDNF過表達
　　結果顯示IBS-D FSN能夠快速誘導p38MAPK磷酸化增加，但對p65蛋白無明顯影響。PAR-2抑制劑ENMD-1068可阻斷IBS-D FSN對p38磷酸化的誘導。p38 MAPK抑制劑SB203580可阻斷IBS-DFSN對Caco-2細胞BDNF蛋白的上調，但NF-κB

8、抑制劑PDTC則無此作用。
　　5.結直腸灌注IBS-D糞便上清液可誘導C57小鼠結腸高敏感，其作用依賴于結腸PAR-2激活和BDNF的過表達
　　Western blotting結果顯示，與對照FSN相比，結腸灌注IBS-D FSN可顯著上調小鼠結腸上皮BDNF蛋白的表達，且此作用可被FUT-175和ENMD-1068抑制。免疫組化驗證了Western blotting結果，顯示上調的BDNF主要分布于結腸上皮和粘膜。

9、r>　　第二部分
　　1.研究對象基本情況
　　連續(xù)納入符合羅馬Ⅲ診斷標準的IBS患者30例和正常對照者30例。IBS患者腹痛程度和腹痛頻率評分均顯著高于對照組，IBS亞型之間無明顯差異。IBS-D患者糞便上清(IBS-D FSN)絲氨酸蛋白酶活力為明顯高于正常對照(median(IQR)1521(905.3-1983) U/mg蛋白vs.465(264.3-708.0) U/mg蛋白; P＜0.0001）。絲氨酸蛋白酶抑制

10、劑抑肽酶(aprotinin)顯著降低IBS-D FSN絲氨酸蛋白酶活力(245(109.8-413.5) U/mg蛋白;P＜0.001）。而IBS-C FSN絲氨酸蛋白酶活力(455(253-905.5) U/mg蛋白）與對照無明顯差異。
　　2.BDNF及其受體TrkB與腸膠質細胞(EGC)在腸粘膜分布緊密相關。
　　3.IBS患者結腸粘膜BDNF，TrkB，GFAP表達升高在本研究群體中，免疫組化和western bl

11、otting再次驗證了IBS患者結腸BDNF表達顯著高于對照者，與我們之前發(fā)表另一IBS研究群體的研究結果一致。
　　4.IBS患者結腸腸膠質細胞(EGC)伴有顯著的超微結構改變
　　5.IBS患者結腸腸膠質細胞表達P物質升高
　　6.GFAP與SP表達與IBS腹痛評分顯著相關
　　第三部分
　　1.IBS-D FSN誘導的內臟高敏感小鼠結腸過表達BDNF，GFAP, TrkB和SP
　　選利用第二部

12、分研究中收集的IBS-D FSN進行小鼠結腸灌注成功建立小鼠內臟高敏感模型后，檢測結腸BDNF，TrkB和GFAP蛋白表達。Western blotting發(fā)現(xiàn)模型組小鼠BDNF，GFAP和TrkB蛋白的表達量顯著高于對照FSN組和抑肽酶預處理的IBS-D FSN組。免疫熒光雙標染色檢測模型組和對照組結腸粘膜總SP和EGC特異表達的SP的表達量均顯著高于對照FSN組和抑肽酶預處理的IBS-DFSN組。
　　2.BDNF基因敲除抑制

13、IBS-D FSN對小鼠內臟高敏感的誘導作用
　　3.BDNF基因敲除抑制IBS-D FSN對小鼠結腸BDNF，GFAP，TrkB和SP表達的上調
　　4.氟代檸檬酸誘導的腸膠質細胞功能障礙抑制IBS-D FSN對內臟高敏感的誘導及SP的表達
　　5.重組人BDNF(r-HuBDNF)體外通過TrkB-PLCγ1通路直接激活腸膠質細胞
　　6.r-HuBDNF激活的EGC培養(yǎng)液上清而非r-HuBDNF本身可誘導腸

14、系膜感覺傳入神經的放電反應
　　7.r-HuBDNF能夠增強腸系膜傳入神經的機械敏感性，且此作用可被激活的EGC協(xié)同性增強
　　最后，我們進一步探討r-HuBDNF及其激活的EGC對腸系膜神經機械敏感性的作用。r-HuBDNF激活的EGC培養(yǎng)液上清對大鼠空腸腸系膜神經的機械敏感性增強作用最明顯，r-HuBDNF能夠中等程度的增加腸系膜神經的機械敏感性，但幅度小于r-HuBDNF激活的EGC培養(yǎng)液上清。應用TrkB拮抗劑預處理

15、腸系膜神經可部分抑制r-HuBDNF激活的EGC培養(yǎng)液上清對機械敏感性的增強作用，而應用TrkB拮抗劑和NK1拮抗劑共同預處理腸系膜神經則可顯著抑制r-HuBDNF激活的EGC培養(yǎng)液上清對機械敏感性的增強作用。綜上，我們的研究結果表明盡管r-HuBDNF自身不能直接誘發(fā)腸系膜神經放電，卻能夠誘導腸系膜傳入神經的機械敏感性增加。激活的EGC也能夠通過釋放包括SP在內的神經興奮性物質顯著增加腸系膜傳入神經的機械敏感性，因此我們認為r-HuB

16、DNF和激活的EGC對腸系膜傳入神經的機械敏感性具有協(xié)同性增加作用。
　　結論:
　　第一部分
　　1.IBS-D糞便上清對腸上皮細胞BDNF的基因表達具有顯著促進作用，并通過PAR-2-p38 MAPK信號通路激活腸上皮細胞BDNF的表達，且此作用依賴于糞便上清中升高的絲氨酸蛋白酶活性。
　　2.IBS-D糞便上清可體內誘導結腸高敏感，且此過程依賴于結腸上皮PAR-2受體的激活和BDNF表達增高。
　　第

17、二部分
　　1.IBS患者結腸粘膜EGC可能存在激活，表現(xiàn)為GFAP表達增加以及興奮性神經遞質SP的表達增多。
　　2.IBS患者結腸粘膜BDNF，EGC以及傳入神經末梢密切相關，可能存在相互作用的增強。
　　3.BDNF及其相關的EGC改變與IBS患者腹痛癥狀具有正相關性。
　　第三部分
　　1.結腸BDNF過表達可增強腸感覺傳入神經的化學和機械敏感性，但本身不能誘發(fā)神經興奮性放電。
　　2.結腸B