長鏈非編碼RNA-H19與胃癌相關成纖維細胞活化的相關性研究.pdf

1、目的：
　　對小鼠胃粘成纖維細胞（Mouse gastric mucosa fibroblast,MGMF）進行原代分離培養(yǎng)，并構建其體外活化模型，以模擬體內胃癌相關成纖維細胞的活化，在此基礎之上探索長鏈非編碼RNA-H19基因(Long non-coding RNA-H19，lncRNA-H19)與胃癌相關成纖維細胞（Gastric cancer-associated fibroblast，GCAF）活化的相關性。
　　方

2、法：
　　用組織塊法對小鼠（C57BL/6小鼠）的胃粘膜成纖維細胞進行原代分離培養(yǎng)。成功培養(yǎng)后，在光學顯微鏡下對其形態(tài)學特征進行鑒定，同時輔以免疫熒光染色鑒定細胞內波形絲蛋白(Vimentin)、結蛋白(Desmin)的表達的表達情況，以進一步確認其細胞來源并分析純度;在成功對小鼠胃粘成纖維細胞進行分離培養(yǎng)后，利用與小鼠胃癌細胞(MFC)共培養(yǎng)加上間隙性缺氧處理的方法構建GCAF的體外活化模型，以模擬胃癌微環(huán)境中GCAF的活化過程

3、。建模后，利用ELISA法對細胞培養(yǎng)液中重要的活化效應分子進行檢測，利用實時熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR，qPCR)分別對活化相關蛋白mRNA進行檢測，同時利用CCK-8法、Transwell遷移實驗及流式細胞技術分別對GCAF體外活化模型進行細胞增殖、遷移及凋亡實驗，并用CCK-8法檢測MGMF、GCAF分別與MFC共培養(yǎng)后MFC的增殖活力變化，以驗證GCAF體外活化模型構建是否成功;在成功建模

4、的基礎上，利用qPCR方法對比分析MGMF及GCAF中l(wèi)ncRNA-H19基因的表達情況，以驗證lncRNA-H19與GCAF的活化有相關性。同時，我們進一步利用siRNA干擾基因表達的方法，對GCAF中的lncRNA-H19基因進行干擾沉默，隨后用ELISA法檢測干擾后相關活化因子的表達情況，利用CCK-8法、Transwell侵襲實驗及流式細胞技術分別對干擾表達后的GCAF進行細胞增殖、侵襲及凋亡實驗，以進一步證實lncRNA-H1

5、9與GCAF的活化有明確相關性。均值的比較采用獨立樣本t檢驗或方差分析。
　　結果：
　　光學顯微鏡下見所分離的細胞呈梭狀或兩頭尖的長條狀，大小較均一，呈貼壁放射狀生長，符合成纖維細胞的形態(tài)特征。免疫熒光染色技術鑒定結果顯示波形絲蛋白(Vimentin)表達陽性，而結蛋白(Desmin)表達陰性，符合成纖維細胞的蛋白表達特征;活化模型建立后，GCAF培養(yǎng)液中重要活化效應分子IL-6、TGF-β1、HGF及CXCL12表達量均

6、較MGMF明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同時，GCAF細胞內的α-SMA、FAP相關mRNA的相對表達量也均明顯高于MGMF(P＜0.05)。另外，細胞功能實驗顯示，GCAF的增殖活性及遷移能力較MGMF明顯增強，而細胞凋亡明顯降低，且GCAF能明顯促進MFC的增殖，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);qPCR法對細胞內的lncRNA-H19表達情況檢測顯示，GCAF的表達量較MGMF顯著上調（2.10±0.14VS.1.0

7、0-0.09，P＜0.001）。而lncRNA-H19干擾表達后，GCAF培養(yǎng)液中前述重要活化效應分子的表達量顯著下降(P＜0.05)，同時細胞的增殖活性及侵襲能力也顯著降低，而細胞凋亡率則顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：
　　LncRNA-H19與GCAF的活化具有明顯的相關性，抑制LncRNA-H19的表達可以抑制GCAF的增殖與侵襲，并促進其凋亡，這提示LncRNA-H19有可能成為胃癌的臨床