RNA結合蛋白Rbm47對B細胞Il-10產(chǎn)生和免疫調控作用的影響及機制的研究.pdf

1、B細胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其主要功能為產(chǎn)生抗體、介導體液免疫應答，同時還具備提呈抗原、分泌細胞因子的功能。長期以來，基于對B細胞經(jīng)典作用的認識，人們一方面將其視為機體抵抗病原入侵并保持穩(wěn)態(tài)的主要的免疫效應細胞，另一方面又將其異?；罨暈槎喾N免疫相關疾?。ㄌ貏e是自身免疫?。┑年P鍵致病因素。然而，在過去的二十多年中，人們逐漸發(fā)現(xiàn)一部分B細胞具有免疫負調控作用且對維持機體免疫平衡具有重要意義，根據(jù)其功能特征人們將這部分細胞稱之為調節(jié)性B

2、細胞(Breg，regulatory B cells)。
　　雖然大量的工作都已經(jīng)證實了Breg的存在，但人們對其表面標志物和表型的界定并未達成一致觀點。在Breg具體的研究工作中，白細胞介素-10（IL-10，interleukin-10）的表達水平常被作為公認指標以對Breg進行分析甚至分離。而在目前已發(fā)現(xiàn)的Breg的幾種功能相關分子中，IL-10是Breg發(fā)揮調節(jié)功能的關鍵分子，對其研究也最為廣泛深入。一方面，體內(nèi)外的實驗均

3、表明IL-10缺失的Breg無法正常行使調節(jié)功能;另一方面，多項研究表明B細胞特異性的IL-10缺失會引發(fā)多種免疫相關疾病并與多種病理損傷相關。由于IL-10的表達與Breg的調節(jié)功能的緊密相關，研究B細胞中IL-10產(chǎn)生機制的對于深入認識Breg具有重要的科學意義。
　　IL-10是免疫系統(tǒng)中經(jīng)典的抑炎因子，是調節(jié)機體免疫平衡的重要組分。IL-10可介導包括抑制天然免疫細胞的成熟與活化，抑制炎性細胞因子的分泌，誘導Treg分化等

4、在內(nèi)的多種免疫效應，同時IL-10信號的缺失會導致多種免疫相關疾病的發(fā)生。外源性輸入的IL-10蛋白在體內(nèi)的代謝周期很短，限制了其作為藥物的臨床應用，而利用內(nèi)源性的IL-10則能較好地解決這一問題。內(nèi)源性的IL-10可以來源于多種細胞，但近年來的多項研究表明B細胞是多種生理和病理狀態(tài)下IL-10的主要來源，而通過過繼回輸IL-10分泌的Breg細胞可以緩解和治療多種免疫相關疾病。因此對B細胞中IL-10產(chǎn)生機制的研究具有重要的應用價值。

5、
　　IL-10的表達調控主要發(fā)生在轉錄水平和轉錄后水平。長期以來，對Breg特異性轉錄因子的探索一直沒有停止但始終沒有結果，而已經(jīng)報道的能夠在B細胞中調控IL-10轉錄的幾種轉錄因子，如NF-kB，Bcl6和Blimp1等對B細胞多種其他生物學功能亦有影響，因此目前并沒有在B細胞中找到特異性調節(jié)IL-10表達的轉錄因子。對IL-10轉錄后調控水平的研究表明，IL-10的mRNA的3，非翻譯區(qū)（3'UTR，3'-untransla

6、ted region）具有多個腺嘌呤和尿嘧啶富集序列(ARE，AU-rich element)，當RNA結合蛋白或microRNA與之結合后會對IL-10 mRNA的穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著影響。因此，IL-10的最終蛋白表達水平會顯著地受到轉錄后調控的影響，但目前對B細胞中IL-10表達的轉錄后調控研究仍少有報道。
　　我們應用IL-10抗體標記磁珠分選了IL-10表達陽性和IL-10表達陰性的B細胞并通過基因芯片分析尋找IL-10表達相

7、關的轉錄后調控因子。RBM47是我們篩選到的差異基因之一，其表達產(chǎn)物為一個具有3個RNA識別基序(RNArecognition motif)結構的RNA結合蛋白。已有的研究表明Rbm47可通過轉錄后調控的方式影響mRNA分子的存在狀態(tài)并最終影響多種生物學進程，但其對免疫系統(tǒng)的影響并未見報道。
　　通過基因改造和免疫治療相結合，T細胞、DC細胞、NK細胞及間充質干細胞都已在臨床上用于疾病的治療。Breg由于其獨特的免疫抑制功能也引起

8、了人們將其應用于臨床治療的關注，而一些研究也探索了通過基因改造提高Breg免疫抑制效果的可行性，并得到了肯定的結論。由于IL-10是B細胞行使調節(jié)功能的關鍵分子，而IL-10的蛋白和mRNA都具有不穩(wěn)定性，因此我們假設通過找到并調控IL-10表達相關的轉錄后調控因子可以促進B細胞的調節(jié)性功能，并針對Rbm47這一分子進行了驗證。
　　研究目標
　　檢測IL-10+B細胞中Rbm47的表達情況;探討Rbm47對B細胞IL-10

9、產(chǎn)生及免疫抑制作用的影響及潛在機制;加深對Breg免疫調控作用形成機制的認識并為推進其臨床應用轉化提供理論依據(jù)。
　　方法與結果
　　1.應用IL-10抗體標記的磁珠，我們分選了IL-10分泌陽性和IL-10分泌陰性的B細胞，并應用表達譜芯片技術分析差異表達的轉錄后調控相關蛋白，RBM47在IL-10分泌陽性的B細胞中表達顯著升高。
　　2.通過應用LPS體外誘導IL-10和及應用IL-10-GFP報告基因小鼠分選IL

10、-10分泌陽性和IL-10分泌陰性細胞，我們對基因芯片的結果進行了驗證。結果表明，B細胞中的Rbm47在IL-10誘導過程中表達升高，且特異性表達在IL-10分泌陽性的B細胞中。
　　3.通過干擾慢病毒感染和嘌呤霉素篩選，我們建立了Rbm47敲低的SP2/0細胞系。通過應用qPCR和ELISA對其IL-10表達水平的檢測，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比Rbm47敲低的SP2/0細胞系中IL-10的mRNA和蛋白表達水平都有顯著下降。

11、　　4.通過雙熒光素酶報告基因實驗和RNA結合蛋白免疫沉淀(RIP，RNA BindingProtein Immunoprecipitation)實驗我們檢測了Rbm47對IL-10啟動子和mRNA的結合水平。結果表明Rbm47可結合IL-10的mRNA而不結合IL-10的啟動子。
　　5.通過應用放線菌素D抑制mRNA合成，并在不同時間點收集mRNA樣品以測定IL-10mRNA的衰減速率，我們分析了Rbm47對IL-10mRNA

12、穩(wěn)定性的影響。結果表明，敲低Rbm47后B細胞中IL-10的降解速率顯著加快，而在過表達Rbm47的體系中IL-10的降解速率則被減緩。
　　6.通過應用Rbm47過表達逆轉錄病毒感染原代B細胞，我們進一步分析了Rbm47對B細胞中IL-10表達的影響。qPCR和FACS的結果都表明Rbm47過表達可以促進B細胞中IL-10的表達。
　　7.通過流式分選Rbm47表達逆轉錄病毒感染的B細胞及對照細胞并將其與T淋巴細胞共培養(yǎng)，

13、我們在體外分析了Rbm47對B細胞調節(jié)性功能的影響。結果表明，Rbm47過表達可以促進B細胞分泌IL-10并促進Treg的誘導分化。
　　8.通過給IL-10-GFP報告基因小鼠飼喂?jié)舛葹?％的DSS進行潰瘍性結腸炎(UC，ulcerative colitis)造模，我們檢測了其腸系膜淋巴結中IL-10表達陽性B細胞的豐度及腸系膜淋巴結B細胞中IL-10和Rbm47表達水平。結果表明，與正常小鼠相比，UC小鼠腸系膜淋巴結中IL-1

14、0分泌B細胞的比例減少，同時其腸系膜淋巴結B細胞中IL-10和Rbm47的表達水平降低。
　　9.通過過繼轉移Rbm47表達逆轉錄病毒感染的B細胞及對照B細胞對DSS誘導UC小鼠進行治療，我們在體內(nèi)評價了Rbm47對B細胞調節(jié)性功能的影響。結果表明，與對照組相比Rbm47過表達B細胞可減緩UC小鼠體重降低，減輕腸道損傷并增加腸系膜淋巴結中Treg的比例，緩解UC小鼠的疾病的嚴重程度。
　　結論：
　　綜上，本研究表明R