Progranulin保護糖尿病腎病足細胞損傷的作用機制.pdf

1、研究背景:糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是導致終末期腎病(end stagerenal disease，ESRD)的最重要的誘因之一，嚴重威脅人類的生命健康。糖尿病腎病的發(fā)病機制尤為復雜，主要包括糖脂代謝紊亂、血流動力學、氧化應激、炎癥反應以及遺傳因素等。足細胞(podocyte)是維持腎小球內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要組成部分，足細胞與腎小球內(nèi)皮細胞和基底膜共同組成了腎小球濾過屏障，足細胞損傷是糖尿病腎病的早期事件，

2、可導致濾過屏障遭到破壞，產(chǎn)生蛋白尿，最終加重腎臟損傷。但是，在糖尿病腎病中造成足細胞損傷的機制尚不完全明確。
　　顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)是一種自分泌型生長因子，廣泛表達分布于體內(nèi)各種組織與器官，例如神經(jīng)細胞、軟骨細胞、免疫細胞以及上皮細胞等。PGRN具有諸多生物學功能，廣泛參與到多種病理生理過程中，如腫瘤的發(fā)生發(fā)展、自身免疫類疾病、組織損傷修復、傷口愈合等。雖然課題組前期的研究證明PGRN可以通過負調(diào)控N

3、OD2介導的信號通路在急性腎損傷中起到保護作用，但在糖尿病腎病中是否發(fā)揮作用尚不清楚。
　　研究表明，自噬在糖尿病腎病的病理進程中發(fā)揮著重要的作用，正常生理條件下足細胞保持著較高的自噬水平，糖尿病腎病發(fā)生時足細胞自噬水平降低導致足細胞受損進而加重腎損傷。報道顯示，AMPK是自噬的激活劑，AMPK可以通過直接磷酸化自噬啟動蛋白ULK1從而促進自噬，進而在糖尿病腎病中起到保護作用。因此本實驗主要為了探究PGRN在糖尿病腎病中的作用，以

4、及是否與自噬，AMPK信號通路有關(guān)。
　　研究方法與結(jié)果
　　1.PGRN在糖尿病腎病中的表達變化
　　選取8-12周齡雄性野生型(wild type，WT) C57BL/6J小鼠，單腎摘除后恢復一周，腹腔注射鏈脲佐霉素(streptozotocin，STZ)100mg/kg連續(xù)三天誘導糖尿病腎病。當小鼠模型構(gòu)建成功后，使用蛋白免疫印跡法(Western blot，WB)、Real-time RT-PCR、免疫熒光(i

5、mmunofluorescence，IF)和免疫組化(immunohistochemistry，IHC)，檢測PGRN在腎皮質(zhì)中表達變化及分布情況，結(jié)果顯示PGRN在糖尿病腎病模型組腎皮質(zhì)中與對照組相比表達明顯下降。同時體外高糖分別刺激人腎小球足細胞(human podocyte，HPC)、內(nèi)皮細胞(glomerular endothelial cell，GEnC)和大鼠系膜細胞(rat messangial cell，RMC)結(jié)果顯示

6、，腎小球足細胞和內(nèi)皮細胞中的PGRN均表達下降。
　　2.PGRN在糖尿病腎病損傷中的作用
　　適齡野生型雄性C57BL/6小鼠和Grn基因敲除鼠(B6(Cg)-Grntm1.1Aidi/J)隨機分組，分別構(gòu)建糖尿病腎病模型和對照組。通過PAS對野生型和Grn基因敲除組腎臟石蠟切片染色，透射電鏡觀察小鼠足細胞損傷。結(jié)果顯示，在糖尿病腎病組PGRN的缺失導致了腎皮質(zhì)中腎小球系膜基質(zhì)增生加重。透射電鏡結(jié)果顯示PGRN的缺失加重了

7、腎小球足細胞損傷，導致足細胞足突的融合消失。IF標記足細胞特異性蛋白Nephrin、Podocin結(jié)果顯示PGRN的缺失加重了足細胞功能蛋白的損傷。同時Real-time RT-PCR檢測野生型與Grn基因敲除鼠腎皮質(zhì)炎性因子與趨化因子的變化，結(jié)果顯示，PGRN的缺失導致腎皮質(zhì)中炎性因子與趨化因子較野生型糖尿病腎病組更高。體外流式細胞術(shù)檢測足細胞凋亡水平，結(jié)果顯示加入重組PGRN可以明顯降低高糖引起的細胞凋亡，WB檢測足細胞功能蛋白Ne

8、phrin，結(jié)果顯示加入重組PGRN可恢復高糖誘導的Nephrin蛋白水平的降低。
　　3.PGRN在糖尿病腎病損傷中的作用機制
　　WB檢測野生型與Grn基因敲除鼠腎皮質(zhì)中LC3B等自噬相關(guān)分子，結(jié)果顯示Grn基因敲除鼠糖尿病腎病組較野生型糖尿病腎病組的自噬水平更低。體外結(jié)果顯示足細胞高糖條件下自噬水平顯著降低，加入重組PGRN后自噬水平恢復，Tandem實驗觀察自噬流變化表明加入重組PGRN可以恢復足細胞高糖條件下自噬流

9、水平。同時WB檢測自噬啟動蛋白ULK1磷酸化水平，結(jié)果表明高糖條件下ULK1磷酸化水平降低，加入重組PGRN可以恢復磷酸化水平。進一步WB檢測糖尿病腎病腎皮質(zhì)AMPK信號通路的水平，結(jié)果顯示糖尿病腎病組中Grn基因敲除較野生型AMPK信號通路進一步降低。
　　結(jié)論與創(chuàng)新性:
　　1.糖尿病腎病小鼠模型中PGRN顯著降低，PGRN的缺失加重糖尿病腎病足細胞損傷。
　　2.PGRN可以通過激活AMPK信號通路促進ULK1磷