Eaf2通過Wnt信號通路抑制氧化應激誘導的人晶狀體上皮細胞凋亡的研究.pdf

1、1前言:
　　目前白內障患者導致的眼盲占全世界眼盲患者的50％，現在公認眼內晶狀體受到氧化應激的損傷是白內障的主要原因。上皮細胞是氧化應激的主要目標。研究表明，過氧化氫誘導的氧化應激能夠刺激人晶狀體上皮(HLE)細胞凋亡，還有研究顯示除了先天性白內障以外，其他各種類型的白內障發(fā)生的細胞學基礎都被認為是和細胞凋亡有關。因此通過研究人HLE細胞凋亡的機制可能會為白內障防治提供更多理論依據。
　　2目的:
　　研究在氧化應激

2、誘導的HLE細胞的凋亡中Eaf2基因所起的作用和相關分子機制，并進一步探討Eaf2基因如何通過抑制caspase-3活性、激活Wnt信號通路保護HLE細胞抑制過氧化氫導致的凋亡。
　　3方法:
　　3.1細胞培養(yǎng):在含20％ FBS的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)HLE-B3細胞。培養(yǎng)條件:5％CO2、飽和濕度、37℃。
　　3.2過氧化氫誘導HLE-B3細胞凋亡:將HLE-B3細胞用50μM過氧化氫別處理4h、8h和12h。

3、r>　　3.3載體構建和細胞轉染:構建Eaf2的過表達，Eaf2基因的CDS全長被克隆并連接到pcDNA3.0載體;用Wnt3a干擾載體(Wnt3ashRNA)敲低Wnt3a，Wnt3ashRNA購自SantaCruz生物，同時匹配其NC，shCon（干擾載體空載）。確認Eaf2過表達的細胞，同時轉染shWnt3a/shCon。
　　3.4檢測分析細胞凋亡:將過氧化氫處理HLEC-B3細胞后，用流式儀檢測細胞，計算凋亡率。

4、　　3.5 RNA提取和RT-PCR分析:采用TRIZOL法從細胞中提取總RNA，將RNA逆轉成cDNA，用2-(ΔΔ)Ct計算方法來比較各組間β-catenin，caspase3，Eaf2，andWnt3a mRNA的表達水平。
　　3.6免疫印跡分析:采用western blot檢測β-catenin，caspase3，Eaf2，and Wnt3a的蛋白水平。
　　3.7免疫細胞化學:免疫熒光檢測Eaf2和Wnt3a在細

5、胞中的定位情況。
　　4結果:
　　4.1.構建H2O2誘導的HLE細胞凋亡的模型。
　　分別用50μM H2O2處理HLE細胞4、8、12小時后，凋亡細胞的比率均顯著高于對照組（無H2O2處理組），并且凋亡率增加具有時間依賴性。RT-PCR和westernBlot結果均顯示當細胞暴露于H2O2后，HLE-B3細胞中caspase3mRNA和蛋白水平均明顯上調，并且具有時間依賴性;Eaf2mRNA和蛋白水平顯著下調，并

6、且具有時間依賴性。
　　4.2 Eaf2過表達抑制H2O2誘導的HLE細胞凋亡。
　　Eaf2高水平過表達下，凋亡細胞的比例顯著降低(p＜0.001)，同時LDH釋放量顯著降低(p＜0.05)。RT-PCR和western blot分析顯示Eaf2過表達的細胞中，凋亡相關蛋白caspase3、Bax的mRNA和蛋白水平顯著下調;Bcl-2的mRNA和蛋白達水平顯著上調，說明Eaf2基因通過調節(jié)凋亡相關蛋白的表達而抑制過氧化氫

7、誘導晶狀體上皮細胞的凋亡。Eaf2過表達的細胞中Wnt3a和Wnt通路的關鍵蛋白β-catenin的mRNA和蛋白達水平均顯著上調;Wnt通路中的抑制劑GSK3β蛋白水平明顯下調，其磷酸化物p-GSK3β蛋白水平明顯上調，提示Eaf2and Wnt3a信號通路有密切的關系。免疫熒光也顯示Eaf2過表達細胞中Eaf2和Wnt3a明顯上調。
　　4.3 Eaf2通過調控Wnt3a抑制HLE細胞中H2O2誘導的凋亡
　　轉染shW

8、nt3a質粒干擾Wnt3a表達后，即使在Eaf2過表達情況下，HLE-B3細胞凋亡總比率仍顯著增加，同時使已經被壓抑的LDH釋放量增加。RT-PCR和westem blot顯示Wnt3a敲低后caspase3、Bax的mRNA和蛋白水平明顯上調;Bcl-2的mRNA和蛋白水平明顯下調，β-catenin、p-GSK3β的蛋白水平明顯下調;GSK3β蛋白水平明顯上調。說明Wnt3a被敲低后會影響到Eaf2對于HLE細胞的保護作用，Eaf2

9、是通過調控Wnt3a抑制HLE細胞中H2O2誘導的凋亡。
　　5.結論:
　　5.1 H2O2可以誘導晶狀體上皮細胞發(fā)生凋亡。
　　5.2在晶狀體上皮細胞中可有效地轉染Eaf2OE質粒及shWnt3a質粒。
　　5.3 Eaf2蛋白對過氧化氫誘導的晶狀體上皮細胞的凋亡具有抑制作用。
　　5.4第一次證明Eaf2基因轉錄產物可以保護HLE細胞免受暴露于過氧化氫導致的氧化應激損害。
　　5.5 Eaf2通