碲化鎘(CdTe)量子點對大鼠海馬體的毒性效應及作用機制研究.pdf

1、新興的納米科技可以極大地改變目前的醫(yī)療現(xiàn)狀，可解決許多醫(yī)學難題，提供有針對性的醫(yī)學診斷和治療。量子點(QDs)作為常用納米材料之一，獨特的光學性質不僅能保證其熒光強度長期穩(wěn)定，而且能夠同時檢測多個信號。但是，若要將量子點應用于生物醫(yī)學，尤其是臨床醫(yī)學領域，需要充分了解其生物安全性，因此，深入探討量子點的毒性、毒作用機制及生物安全性評價就變得至關重要。關于量子點毒性效應的研究已有多篇報道，但是與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關的毒理學研究資料卻十分匱乏。

2、鑒于量子點能夠在神經(jīng)科學的基礎研究和神經(jīng)系統(tǒng)相關疾病的診斷和治療中起到重要作用，對其進行全面而深入的神經(jīng)毒性研究就顯得十分迫切和必要。
　　本論文主要探討量子點對大鼠海馬體的神經(jīng)毒性，結合本課題組長期以來對巰基丙酸(MPA)修飾的CdTe量子點已經(jīng)進行的肝毒性、腎毒性、呼吸毒性等的毒理學研究結果，以及生物醫(yī)學領域的實際應用情況，從基因、分子、細胞、器官、模式生物、整體動物的不同研究水平，探索了CdTe量子點可能導致大鼠海馬體發(fā)生的

3、毒性作用，以及導致這些毒性作用可能的作用機制。
　　具體的研究內容分為以下四個部分:
　　1.CdTe量子點的制備與表征。應用電化學方法合成高質量的水溶性MPA修飾的CdTe量子點，通過透射電子顯微鏡(TEM)、紫外-可見光分光光度儀(UV-visible light spectrophotometry)、熒光分光光度儀(fluorescence spectrophotometry)、X-射線衍射儀(X-ray diffra

4、ctometer)和Malvern粒徑分析儀(Malvern size analyzer)等對量子點進行表征分析。
　　2.探討CdTe量子點對模式生物——秀麗隱桿線蟲（以下簡稱秀麗線蟲或線蟲）的神經(jīng)毒性作用。以秀麗隱桿線蟲作為模式生物，研究CdTe量子點對其運動行為、攝食行為、學習記憶等神經(jīng)系統(tǒng)相關行為學的影響，在此基礎上進一步研究CdTe量子點導致這些毒性效應可能參與的在基因水平上的神經(jīng)遞質傳導和接收途徑。
　　3.研究

5、CdTe量子點對原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元的毒性作用機制。以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元為體外研究模型，研究CdTe量子點對神經(jīng)元活性、凋亡發(fā)生、細胞內活性氧生成和胞內鈣平衡的影響，以及存在的劑量-效應關系。根據(jù)量子點的特殊理化性質，分析了不同粒徑的CdTe量子點導致的細胞毒性效應間的差異。具體從神經(jīng)電生理角度分析了CdTe量子點導致神經(jīng)元胞內鈣水平升高的作用機制。
　　4.研究CdTe量子點對大鼠海馬體的神經(jīng)毒性作用。給予Wistar

6、大鼠一定劑量的CdTe量子點，觀察對其學習記憶能力的影響，并從大鼠的血液生化和組織病理學結果找尋量子點造成這些行為學損傷的原因;再通過全轉錄組測序更為深入而全面地研究CdTe量子點對大鼠海馬體造成的毒性效應，以及參與的分子作用機制和靶點;并根據(jù)轉錄組測序數(shù)據(jù)進一步深入研究CdTe量子點參與的三條主要分子信號通路——與學習記憶能力相關的PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路、以及與炎癥反應相關的NF-κB信號通路。
　　取得的主

7、要研究結果如下:
　　1.量子點的制備和表征:本研究所用水溶性MPA修飾的CdTe量子點是通過完善而成熟的電化學方法制備合成。通過水浴低溫反應2h和20h分別制備獲得了平均直徑為2.2nm和3.5nm的CdTe量子點，分別發(fā)射綠色和紅色熒光。經(jīng)各種理化檢測發(fā)現(xiàn)，制備的CdTe量子點光學性能良好，熒光強度至少可保持四周不變。電鏡結果顯示量子點呈球形、顆粒分散均勻、穩(wěn)定性良好。兩種量子點在細胞培養(yǎng)液中均帶負電。表明制備的水溶性MPA修

8、飾的CdTe量子點達到設計標準，可滿足本研究的所有實驗要求。
　　2.秀麗線蟲研究表明:CdTe量子點暴露可以損傷秀麗線蟲的運動行為、攝食能力、化學趨向性學習能力和溫度趨向性記憶能力，并且量子點暴露72h造成的毒性效應比24h明顯(P＜0.05)。而這些毒性效應發(fā)生的原因與CdTe量子點可以影響編碼神經(jīng)遞質谷氨酸、五羥色胺和多巴胺轉運蛋白和受體的基因表達量有關。此外，CdTe量子點暴露的線蟲體內ROS生成量的顯著增加，可見量子點導

9、致的氧化應激與染毒線蟲表現(xiàn)出的神經(jīng)行為毒性反應也密切相關。但是，由于生物體神經(jīng)傳導的復雜性和相關基因的多元性，CdTe量子點對生物體神經(jīng)系統(tǒng)可能造成的毒性效應以及毒作用機制需要用動物實驗進行驗證。
　　3.體外研究表明:CdTe量子點可以顯著降低原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元的細胞活性，促進其凋亡，具有明顯的劑量—效應關系。這些毒性效應的發(fā)生可能是由于CdTe量子點促進神經(jīng)元胞內ROS過量生成，從而造成細胞氧化應激損傷和胞內鈣失衡導致的

10、。通過抗氧化劑NAC驗證了ROS過量產(chǎn)生是CdTe量子點造成細胞毒性的作用機制之一。而對于作用機制更為復雜的細胞內鈣水平升高，除了可以通過CdTe量子點造成的氧化應激反應來解釋，還通過神經(jīng)電生理學經(jīng)典的膜片鉗技術進一步進行了探索。結果表明，CdTe量子點增加了細胞膜上被激活的HVA鈣通道的數(shù)量，同時抑制其失活，從而促進鈣離子從胞外流向胞內。CdTe量子點還可以增加鈉通道的電流幅度，加速鈉通道的激活和失活，減緩了其失活后恢復，通過細胞膜上

11、鈣鈉交換活動，間接促進胞外鈣離子內流，而神經(jīng)元內嚴重的鈣穩(wěn)態(tài)失衡將不可避免地造成神經(jīng)元損傷。但是，基于體外培養(yǎng)細胞的毒理學實驗結果的說服力仍然不夠，還需用CdTe量子點對活體動物的神經(jīng)系統(tǒng)毒性效應進行研究。
　　4.體內研究表明:用大鼠海馬體在體注射CdTe量子點的方法，模擬量子點定向給藥，并使得CdTe量子點在大鼠海馬體成功聚集。該染毒方式避免了量子點結合的生物分子可能對其生物效應的影響，選擇了與前期研究同樣的CdTe量子點，保

12、證了整個實驗的連貫性。CdTe量子點暴露可以導致大鼠的學習效率和空間記憶能力出現(xiàn)一定的損傷，這可能與在大腦海馬區(qū)觀察到的病理學變化以及神經(jīng)元和突觸連接上超微結構的變化有關。通過全轉錄組測序技術獲得了CdTe量子點造成神經(jīng)毒性可能作用的靶點基因。根據(jù)這些調控基因提供的生物學信息，進一步完善分析了CdTe量子點造成海馬體毒性效應參與的Toll樣受體信號通路的作用機制。表明CdTe量子點暴露可以通過抑制PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通

13、路的關鍵生物分子蛋白AKT和ERK1/2的磷酸化，直接或間接下調核蛋白c-FOS表達，損傷突觸可塑性，抑制LTP的形成，從而影響大鼠的學習記憶活動。此外，CdTe量子點還可以激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫細胞——小膠質細胞中的MyD88/TLR2/NF-κB信號通路和NLRP3炎癥小體，導致小膠質細胞分泌促炎性因子IL-1β增加，誘發(fā)炎癥反應。
　　鑒于目前有關量子點神經(jīng)毒性的研究十分有限，本論文旨在揭示CdTe量子點對大鼠海馬體的生物

14、效應和參與的毒性作用途徑。本論文不但明確了CdTe量子點對體外海馬神經(jīng)元和小膠質細胞以及模式生物神經(jīng)系統(tǒng)和大鼠海馬體的毒性效應，并驗證了CdTe量子點造成這些毒作用參與的途徑，例如ROS生成、神經(jīng)傳導損傷等。此外，還用分子生物學實驗方法對CdTe量子點毒性效應可能參與的Toll樣受體信號通路進行了較完整的研究。希望本研究的一系列指標可以作為毒理學觀察終點來評價量子點的神經(jīng)毒性，并能夠為后續(xù)量子點更為深入的神經(jīng)毒性的研究提供有價值的參考。