MicroRNA通過對PPARα的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)參與肝臟脂肪酸代謝.pdf

1、肝臟是機體的重要代謝器官，其代謝活動受激素、酶類、代謝底物及周期節(jié)律等多種因素共同調(diào)節(jié)，并且作為中心樞紐與肌肉、脂肪組織等多個器官進(jìn)行代謝物質(zhì)及代謝水平的緊密聯(lián)系，共同維持機體的運轉(zhuǎn)。伴隨機體飽食或饑餓等能量狀態(tài)，肝臟進(jìn)行分解或合成代謝等應(yīng)答，將糖及脂類物質(zhì)加工分解或合成儲存，最終維持機體的能量平衡。饑餓與飽食狀態(tài)會使機體的能量代謝發(fā)生顯著的變化。飽食狀態(tài)下，肝臟中糖原和TAG的合成、轉(zhuǎn)運增加，而饑餓狀態(tài)下，肝臟的糖原分解、糖異生、脂肪

2、酸氧化和酮體生成增顯著加。PPARα高表達(dá)于FA代謝旺盛的組織中，如肝臟、骨骼肌、棕色脂肪、心臟及腎臟中，屬于PPAR家族成員。PPAR家族是一類配體活化的轉(zhuǎn)錄因子，在脂和碳水化合物的代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。根據(jù)已有文獻(xiàn)報道，PPARα在饑餓狀態(tài)下的肝臟FAO及酮體生成中發(fā)揮重要作用，且饑餓時表達(dá)升高。CPT-1α，ACADM是FAO過程中的2種關(guān)鍵限速酶。CPT-1α介導(dǎo)了LCFA-CoA進(jìn)入線粒體外膜，是FAO的第一步；而ACAD

3、M特異性催化C4-C12直鏈中鏈FA在線粒體中的β氧化。HMGCS2是催化酮體生成的關(guān)鍵限速酶。而這三種酶同時也是PPARα的直接下游靶基因，其表達(dá)均受PPARα轉(zhuǎn)錄上調(diào)。以往的肝臟能量代謝研究多關(guān)注PPARa的翻譯后修飾，包括乙?；?、磷酸化、泛素化、糖基化等，但其分子本身表達(dá)水平的調(diào)節(jié)研究較少。本研究從轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平探討了microRNA通過結(jié)合于PPARa3'UTR調(diào)節(jié)其表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-21，miR-27a，miR-106b，mi

4、R-181a可以通過直接調(diào)節(jié)PPARa，參與饑餓狀態(tài)下肝臟的脂肪酸代謝。
　　目的：
　　[1]通過小鼠體內(nèi)模型，檢測PPARα及microRNA在肝臟饑餓狀態(tài)中的表達(dá)變化，篩選潛在調(diào)控PPARα的microRNA；
　　[2]通過細(xì)胞模型，探討microRNA調(diào)控肝細(xì)胞脂肪酸代謝的作用；
　　[3]驗證microRNA對PPARα的調(diào)控機制；
　　方法及結(jié)果：
　　[1]在本研究中，我們首先通過小鼠

5、饑餓及饑餓再進(jìn)食模型，獲取肝組織，發(fā)現(xiàn)與正常飲食對照組小鼠相比饑餓24h后小鼠肝組織中出現(xiàn)較多的脂滴堆積，油紅O染色呈紅色陽性著色。當(dāng)小鼠饑餓24h再進(jìn)食24后，肝組織中脂滴，顯著減少，趨于正常。通過qRT-PCR的方法檢測其內(nèi)源性PPARα及其下游參與FAO及酮體生成過程的關(guān)鍵限速酶CPT-1α，HMGCS2，ACADM的mRNA表達(dá)變化，實驗結(jié)果與文獻(xiàn)一致，隨小鼠饑餓，PPARα及其下游基因顯著升高，而小鼠再進(jìn)食后其表達(dá)恢復(fù)至接近正

6、常水平。而4種候選microRNA的變化則與之呈負(fù)相關(guān)，提示，這些microRNA可能參與了饑餓狀態(tài)下肝臟中脂肪酸代謝調(diào)控。
　　[2]隨后我們用4種microRNA特異性的mimics轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HegG2，同時進(jìn)行低糖誘導(dǎo)饑餓模型處理。運用qRT-PCR檢測在此模型下PPARα及其下游基因，以及糖異生的限速酶G6Pase的mRNA表達(dá)，同時western blot實驗檢測了PPARα的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞饑餓模型中

7、，200mg/L的低糖處理顯著升高以上基因mRNA的表達(dá)。而轉(zhuǎn)染針對4種microRNA的mimics后，其mRNA升高受到顯著抑制，且表達(dá)趨于正常水平,甚至低于正常對照。western blot與之一致，提示，miR-21，miR-27a，miR-106b，miR-181a可能是通過調(diào)節(jié)PPARα參與了饑餓條件下肝細(xì)胞的脂肪酸代謝。
　　[3]最后，我們證實了miR-21，miR-27a，miR-106b，miR-181a的特異

8、性inhibitor可以上調(diào)HepG2細(xì)胞中PPARα及其下游基因CPT-1a和ACADM mRNA的表達(dá)變化。qRT-PCR結(jié)果顯示，4種microRNA的干涉，均可顯著上調(diào)以上基因的表達(dá)，雖然抑制miR-21的上調(diào)效果雖較低，但仍具有統(tǒng)計學(xué)意義。另外通過生物信息學(xué)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-21，miR-27a，miR-106b，miR-181a在PPARα3'UTR有潛在結(jié)合位點，隨后我們克隆了PPARα3'UTR上兩段富含microRNA

9、識別序列的片段，通過熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，證實了4種microRNA可以通過直接結(jié)合于PPARα3'UTR，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控PPARα的表達(dá)。
　　結(jié)論：本研究從轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)角度出發(fā)，探討了PPARα在饑餓狀態(tài)下肝臟脂肪酸代謝中的功能受miR-21，miR-27a，miR-106b，miR-181a調(diào)節(jié)。通過qRT-PCR、western blot等方法驗證PPARα在饑餓小鼠肝組織中顯著上調(diào)，且隨再進(jìn)食其表達(dá)降低。4種mi