MicroRNA通過對PPARα的轉錄后調節(jié)參與肝臟脂肪酸代謝.pdf

1、肝臟是機體的重要代謝器官，其代謝活動受激素、酶類、代謝底物及周期節(jié)律等多種因素共同調節(jié)，并且作為中心樞紐與肌肉、脂肪組織等多個器官進行代謝物質及代謝水平的緊密聯(lián)系，共同維持機體的運轉。伴隨機體飽食或饑餓等能量狀態(tài)，肝臟進行分解或合成代謝等應答，將糖及脂類物質加工分解或合成儲存，最終維持機體的能量平衡。饑餓與飽食狀態(tài)會使機體的能量代謝發(fā)生顯著的變化。飽食狀態(tài)下，肝臟中糖原和TAG的合成、轉運增加，而饑餓狀態(tài)下，肝臟的糖原分解、糖異生、脂肪

2、酸氧化和酮體生成增顯著加。PPARα高表達于FA代謝旺盛的組織中，如肝臟、骨骼肌、棕色脂肪、心臟及腎臟中，屬于PPAR家族成員。PPAR家族是一類配體活化的轉錄因子，在脂和碳水化合物的代謝調節(jié)中發(fā)揮了重要作用。根據已有文獻報道，PPARα在饑餓狀態(tài)下的肝臟FAO及酮體生成中發(fā)揮重要作用，且饑餓時表達升高。CPT-1α，ACADM是FAO過程中的2種關鍵限速酶。CPT-1α介導了LCFA-CoA進入線粒體外膜，是FAO的第一步；而ACAD

3、M特異性催化C4-C12直鏈中鏈FA在線粒體中的β氧化。HMGCS2是催化酮體生成的關鍵限速酶。而這三種酶同時也是PPARα的直接下游靶基因，其表達均受PPARα轉錄上調。以往的肝臟能量代謝研究多關注PPARa的翻譯后修飾，包括乙酰化、磷酸化、泛素化、糖基化等，但其分子本身表達水平的調節(jié)研究較少。本研究從轉錄后調控水平探討了microRNA通過結合于PPARa3'UTR調節(jié)其表達，發(fā)現miR-21，miR-27a，miR-106b，mi

4、R-181a可以通過直接調節(jié)PPARa，參與饑餓狀態(tài)下肝臟的脂肪酸代謝。
　　目的：
　　[1]通過小鼠體內模型，檢測PPARα及microRNA在肝臟饑餓狀態(tài)中的表達變化，篩選潛在調控PPARα的microRNA；
　　[2]通過細胞模型，探討microRNA調控肝細胞脂肪酸代謝的作用；
　　[3]驗證microRNA對PPARα的調控機制；
　　方法及結果：
　　[1]在本研究中，我們首先通過小鼠

5、饑餓及饑餓再進食模型，獲取肝組織，發(fā)現與正常飲食對照組小鼠相比饑餓24h后小鼠肝組織中出現較多的脂滴堆積，油紅O染色呈紅色陽性著色。當小鼠饑餓24h再進食24后，肝組織中脂滴，顯著減少，趨于正常。通過qRT-PCR的方法檢測其內源性PPARα及其下游參與FAO及酮體生成過程的關鍵限速酶CPT-1α，HMGCS2，ACADM的mRNA表達變化，實驗結果與文獻一致，隨小鼠饑餓，PPARα及其下游基因顯著升高，而小鼠再進食后其表達恢復至接近正

6、常水平。而4種候選microRNA的變化則與之呈負相關，提示，這些microRNA可能參與了饑餓狀態(tài)下肝臟中脂肪酸代謝調控。
　　[2]隨后我們用4種microRNA特異性的mimics轉染人肝癌細胞系HegG2，同時進行低糖誘導饑餓模型處理。運用qRT-PCR檢測在此模型下PPARα及其下游基因，以及糖異生的限速酶G6Pase的mRNA表達，同時western blot實驗檢測了PPARα的蛋白表達，發(fā)現HepG2細胞饑餓模型中

7、，200mg/L的低糖處理顯著升高以上基因mRNA的表達。而轉染針對4種microRNA的mimics后，其mRNA升高受到顯著抑制，且表達趨于正常水平,甚至低于正常對照。western blot與之一致，提示，miR-21，miR-27a，miR-106b，miR-181a可能是通過調節(jié)PPARα參與了饑餓條件下肝細胞的脂肪酸代謝。
　　[3]最后，我們證實了miR-21，miR-27a，miR-106b，miR-181a的特異

8、性inhibitor可以上調HepG2細胞中PPARα及其下游基因CPT-1a和ACADM mRNA的表達變化。qRT-PCR結果顯示，4種microRNA的干涉，均可顯著上調以上基因的表達，雖然抑制miR-21的上調效果雖較低，但仍具有統(tǒng)計學意義。另外通過生物信息學預測，發(fā)現miR-21，miR-27a，miR-106b，miR-181a在PPARα3'UTR有潛在結合位點，隨后我們克隆了PPARα3'UTR上兩段富含microRNA

9、識別序列的片段，通過熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，證實了4種microRNA可以通過直接結合于PPARα3'UTR，從而在轉錄后水平調控PPARα的表達。
　　結論：本研究從轉錄后調節(jié)角度出發(fā)，探討了PPARα在饑餓狀態(tài)下肝臟脂肪酸代謝中的功能受miR-21，miR-27a，miR-106b，miR-181a調節(jié)。通過qRT-PCR、western blot等方法驗證PPARα在饑餓小鼠肝組織中顯著上調，且隨再進食其表達降低。4種mi