運動發(fā)酵單胞菌中實時定量PCR體系的建立及主碳代謝途徑基因轉錄初步分析.pdf

1、運動發(fā)酵單胞菌ZM4（ZM4）因其高的醇產(chǎn)率和耐受力受到越來越多的關注，成為生物乙醇生產(chǎn)的候選菌株。運動發(fā)酵單胞菌ZM4基因組測序及全基因組模型發(fā)表，對運動發(fā)酵單胞菌的代謝網(wǎng)絡、產(chǎn)醇策略等有了很大指導意義，特別是與主碳轉運及代謝、產(chǎn)醇相關的基因受到了較多的關注。通過分析轉錄組，獲得與基因轉錄水平有關的信息，可以揭示基因表達與一些生命現(xiàn)象之間的內(nèi)在聯(lián)系，加深對運動發(fā)酵單胞菌的認識，有利于進一步利用運動發(fā)酵單胞菌。
　　結合RNA的反

2、轉錄體系，實時定量PCR技術已成為對各種組織細胞進行轉錄研究的重要技術手段。而熒光定量標準化概念——MIQE的提出，將引導今后定量實驗的規(guī)范性，確保實驗結果的完整性、重現(xiàn)性和可靠性，促進實驗室之間的一致性。
　　目前Real-timeqPCR技術在運動發(fā)酵單胞菌中的研究很少。本文主要目的是在ZM4中建立Real-timeqPCR技術平臺，并確定一套可靠的用于運動發(fā)酵單胞菌轉錄分析數(shù)據(jù)標準化的體系，包括內(nèi)參基因的選擇，對目的基因轉錄

3、水平的檢測及分析，確定在不同生長階段ZM4主碳代謝途徑基因轉錄水平的變化等，進而將該體系應用于不同碳源及糖濃度下主碳代謝途徑基因轉錄水平變化分析。
　　本文建立了ZM4總RNA提取及定量的方法體系和在ZM4中利用real-timeqPCR進行轉錄分析的詳細方法。在內(nèi)參基因的篩選中，利用real-timeqPCR技術研究了18個候選內(nèi)參基因在ZM4整個生長周期中的mRNA水平。利用geNorm、NormFinder和BestKeep

4、er三個軟件綜合評價，篩選出7個相對穩(wěn)定表達的候選內(nèi)參基因，最終確定了ZMO0367，ZMO0487和ZMO1955作為內(nèi)參基因進行數(shù)據(jù)標準化，分析ZM4不同生長階段主碳代謝途徑基因轉錄水平變化。以此確立了Real-timeqPCR技術平臺用于運動發(fā)酵單胞菌轉錄分析數(shù)據(jù)標準化的體系。
　　在此基礎上，本文分析了在RM培養(yǎng)基中分別添加2％葡萄糖，15%葡萄糖，20%葡萄糖，28.5%蔗糖和38%蔗糖5個培養(yǎng)條件下野生型ZM4及突變株

5、ZM4(gfo::FRT)（插入缺失gfo基因）在對數(shù)中期、穩(wěn)定期的26個樣本中主碳代謝途徑基因轉錄水平的差異性，并利用HLPC法分析了5個培養(yǎng)條件下兩菌株代謝物水平的變化。篩選的7個內(nèi)參基因在一定研究條件下有較好的穩(wěn)定性。gfo基因的缺失對運動發(fā)酵單胞菌醇代謝基因轉錄水平有一定的影響，尤其在蔗糖發(fā)酵中較為明顯。ZM4(gfo::FRT)菌株在蔗糖中醇產(chǎn)率較ZM4高，主要是由gfo基因的缺失使得其它基因轉錄水平及代謝流變化引起的。