三角褐指藻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶在碳流分配中的功能.pdf

1、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）光合效率高，繁殖周期短，脂肪酸含量較高，使其具有生產生物柴油的潛力。三角褐指藻目前已完成全基因組測序，高效的基因槍、電穿孔轉化體系也已成功構建，可實現(xiàn)RNA介導的基因沉默，使其成為一個更具吸引力的探索基因功能的模型系統(tǒng)。β-1，3葡聚糖（金藻昆布多糖）是三角褐指藻的主要儲存多糖，其合成底物尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)，由尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose p

2、yrophosphorylase，UGPase)催化可逆反應UTP+G-1-P←→UDPG+PPi生成。馬鈴薯(Solanumtuberosum L)、甘蔗（Saccharum officinarum）、擬南芥(Arabidopsis thaliana)等高等植物UGPase的研究表明，UGPase是碳水化合物代謝途徑中的關鍵酶，并在碳流的分配過程中起著至關重要的作用。為了闡明三角褐指藻UGPase的功能及其對碳流分配的影響，本實驗主要

3、包括兩部分內容:
　　第一部分，根據已有文獻報道，選取不同的磷濃度和溫度對三角褐指藻進行處理，實驗分別設定5個磷梯度和4個溫度梯度，將三角褐指藻培養(yǎng)至指數生長末期;然后采用實時定量PCR(QRT-PCR)技術分析UGPase基因(UGP)的轉錄水平，測定UGPase的酶活和金藻昆布多糖的含量。初步確定三角褐指藻UGP受磷濃度和溫度調控的表達模式。
　　第二部分，首先依據三角褐指藻的全基因組測序結果，對UGP進行初步的信息學分

4、析。根據UGP的信息學分析結果，以遺傳轉化載體pha-T1為骨架，構建反向重復干擾載體(pUGP-IR)和反義干擾載體(pUGP-AS516，pUGP-AS237)。將這些干擾結構用基因槍分別轉入三角褐指藻的基因組。然后我們先用博來霉素(Zeocin)初步篩選出陽性克隆，再用PCR技術檢測抗性基因ble。在此基礎上，我們進一步采用LAPCR技術對干擾載體的整合位點進行定位。最后我們對轉基因藻株進行進一步的研究，分別測定它們的生長曲線和比

5、生長速率，通過QRT-PCR對UGP的轉錄水平進行分析，測定UGPase的酶活，金藻昆布多糖的含量，總脂的合成量等指標。初步確定三角褐指藻UGPase的功能及其在碳流分配中的作用。
　　第一部分實驗的研究結果表明:隨著磷濃度的升高，三角褐指藻內UGP的轉錄水平上調，UGPase的活性升高，同時檢測到金藻昆布多糖的含量增加。無磷組的藻株，金藻昆布多糖的含量僅占細胞干重的5％，比對照組降低了57％，對應的UGP的轉錄水平下調了51％，

6、UGPase酶活也降低了3倍;隨著溫度的逐漸降低，藻細胞內UGP轉錄水平上調，UGPase的活性降低，金藻昆布多糖的合成量減少。10℃組藻細胞金藻昆布多糖的合成量最高(16.7％)，比對照組(12％)增加了35％，對應的對應的UGP的轉錄水平上調了21％，UGPase酶活也增加了35％。本研究表明磷對三角褐指藻UGPase起著正調控作用，溫度對三角褐指藻UGPase起著負調控作用。此外我們推測UGPase可能是金藻昆布多糖合成途徑的關鍵

7、酶。
　　第二部分實驗結果發(fā)現(xiàn):當轉基因藻株的UGP轉錄豐度較野生型三角褐指藻下調4.89倍時，伴隨著UGPase的活性下降69％，對應的金藻昆布多糖含量也降低了54.79％，僅占細胞干重的5％，總脂的合成量卻增加了15％。本研究通過RNA干擾技術手段使三角褐指藻UGPase失活，導致金藻昆布多糖的含量顯著降低，使得更多的總脂積累。這些結果表明，三角褐指藻的UGPase是金藻昆布多糖合成途徑的限速酶，在金藻昆布多糖和脂質的生物合成