SNAP-tag熒光探針與細胞內蛋白標記應用研究.pdf

1、蛋白質是細胞的重要組成部分，是生命活動的主要承擔者。蛋白質的種類繁多，至今還有很多蛋白的性質未知，因此，對活細胞內蛋白質進行特異性熒光標記的技術應運而生。蛋白熒光標記技術因能夠可視化的觀測活細胞內蛋白質的結構與功能而被科學家們廣泛應用。目前常用的蛋白熒光標記技術包括基因編碼的熒光蛋白法、非天然氨基酸法和自標記蛋白標簽技術。但是熒光蛋白存在分子量較大、熒光光譜單一等缺點，而非天然氨基酸法前期基因改造復雜使其應用存在一定的局限性。因此自標記

2、蛋白標簽技術被廣泛的應用于研究活細胞中蛋白質的定位和動態(tài)功能。至今，已經開發(fā)了各種蛋白質標簽以研究活體中的蛋白質系統，SNAP- tag是其中最優(yōu)秀的融合標簽之一。SNAP- tag是人源DNA烷基轉移酶（hAGT）的變體，它能夠專一性的與 O6-芐基鳥嘌呤（O6-benzylguanine，BG）及其衍生物共價連接。目前，各種連接BG底物的熒光探針已被設計出來，而且能專一、快速、不可逆地與SNAP–tag共價連接，這使其廣泛應用于藥物

3、監(jiān)測、蛋白質-蛋白質相互作用、熒光傳感器、和超分辨顯微鏡。雖然已經發(fā)現了很好的熒光探針，但是由于背景光較強這些探針需要在成像之前清除。這不僅耗費時間，而且這種清洗可能會影響實時監(jiān)測一些分子內部的活動（例如受體-配體結合、內吞作用、物質運輸等）。此外，因為多余的熒光探針容易在各種細胞器中堆積，我們很難做到完全清除。因此，為了克服這些困難，開發(fā)了新的具有開關效應的熒光探針。本文采用SNAP-tag蛋白標簽技術，用新型的熒光探針標記體內的蛋白

4、，能夠在免洗的條件下實時監(jiān)控蛋白在細胞內的分布?；诖?，本論文主要做了以下工作：
　　首先，基于熒光團的環(huán)境敏感與淬滅機制，我們設計合成了一系列基于1,8-萘酰亞胺熒光團的熒光探針BGAN-R（R=2C、8C、12C、DM）。通過熒光檢測、動力學檢測等一系列實驗我們發(fā)現BGAN-2C能夠快速、專一的與SNAP-tag共價反應，并且熒光顯著增強。該探針細胞毒性小，在活細胞成像實驗中，其能夠快速地標記細胞內特定的蛋白質。
　　隨

5、后，基于光誘導電子轉移機制我們設計合成了BGAN-DPA探針。通過熒光檢測、動力學等研究，發(fā)現BGAN-DPA與SNAP-tag蛋白結合后熒光顯著增強。并且結合后的蛋白-探針復合物對銅離子有專一性響應。最后將BGAN-DPA應用到HEK293細胞的生物成像研究中，在免洗條件下實現了細胞內線粒體上蛋白的標記及銅離子的檢測。
　　綜上所述，通過設計合成的新型熒光探針，實現了SNAP-tag蛋白在細胞內的可視化追蹤以及細胞內銅離子的檢測