海島棉H276A雄性不育的細胞學與分子生物學基礎研究.pdf

1、細胞質雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility,CMS)是植物雜種優(yōu)勢的利用的基礎，并且已經廣泛的應用于水稻、玉米等作物中。棉花（Gossypium barbadense L.）是重要的經濟作物，也具有顯著的雜種優(yōu)勢。但是由于其CMS資源的匱乏，導致雜種優(yōu)勢的利用受到了極大的限制。因此，開展棉花CMS不育分子機理研究，為更好的利用棉花雜種優(yōu)勢，具有重要的理論和實踐意義。海島棉CMS系H276A是劉冬梅等利用花粉管通

2、道法通過轉紅麻HcPDIL5-2a基因創(chuàng)造的新型胞質不育系。該不育系是由其保持系H276B突變而來，所以其為細胞質近等基因系。在棉花CMS機理的研究中，可以排除由于線粒體基因組進化所造成的非CMS相關冗余遺傳信息的干擾，為棉花CMS分子機理的研究提供了極有價值的研究材料。本研究從細胞學、線粒體基因組及轉錄組學對海島棉CMS系H276A的敗育機理進行了探索，得到以下主要結論:
　　1.采用石蠟切片的方法對不育系和保持系的花藥發(fā)育過程

3、進行了比較分析，確定了海島棉CMS系H276A花藥敗育開始于四分體時期，其敗育特征主要是四分體細胞核液泡化，絨氈層在花藥發(fā)育過程中完整、不發(fā)生降解。花藥細胞超微結構觀察發(fā)現(xiàn)，四分體時期不育系絨氈層細胞部分線粒體出現(xiàn)內膜降解現(xiàn)象。
　　2.利用EcoRⅠ和HindⅢ兩種限制性內切酶對不育系和保持系線粒體基因組進行RFLP分析。結果表明，使用EcoRⅠ進行單酶切時，atp1、nad4、nad7、nad9、ccmb在不育系和保持系之間呈

4、現(xiàn)多態(tài)性，使用HindⅢ進行單酶切時，atp4、nad5、nad9、sdh4、cox3在不育系和保持系之間呈現(xiàn)多態(tài)性，其它基因則不表現(xiàn)多態(tài)性。以上結果表明，不育系H276A在線粒體基因atp1、atp4、nad4、nad5、nad7、nad9、sdh4、ccmb、cox3編碼區(qū)或者編碼區(qū)附近DNA水平上發(fā)生了突變，這些突變可能與棉花CMS的發(fā)生相關。
　　3.以35個棉花線粒體蛋白編碼基因為探針對不育系和保持系進行RNA blot

5、分析，結果表明線粒體基因雖然不存在轉錄本長度多態(tài)性，但發(fā)現(xiàn)不育系中cox3基因轉錄本豐度顯著降低（約是保持系的0.3-0.4倍），對cox3進一步進行熒光定量分析，表明該基因在不育系中的相對表達量是保持系中的0.39倍。由此推測cox3的異常表達與棉花CMS形成過程中能量缺失有關。
　　4.利用RNA環(huán)化的方法對cox3基因的全長轉錄本進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因在保持系中的全長轉錄本為1515bp，其轉錄起始位點和轉錄終止位點分別位于起

6、始密碼子(ATG)上游-412bp及下游1103bp處。在不育系H276A中cox3的轉錄終止位點與保持系相同，然而卻有三個不同的轉錄起始位點分別位于起始密碼子上游-473、-466和-451處。對cox3基因上游序列進行克隆測序發(fā)現(xiàn)，不育系中該基因轉錄起始位點附近發(fā)生了7SNPs突變。由此推測這7SNPs引起cox3在不育系中的轉錄識別位點發(fā)生改變從而導致該基因表達量顯著降低。
　　5.在ATP合成酶基因的相對表達量分析中，以保

7、持系為對照，結果表明除atp4(0.94)外，不育系中atp1(0.7)、atp6(0.64)、atp8(0.59)、atp9(0.61)的表達水平顯著降低。另一方面，在可育F1代中atp1(1.25)、atp4(2.06)、atp6(1.64)、atp8(1.55)和atp9(2.27)表達量顯著升高。表明了恢復基因的引入提高了ATP合成酶基因的表達，同時也進一步確定了棉花CMS的發(fā)生與能量代謝缺失相關。
　　6.采用同源克隆的

8、方法對線粒體ATP合成酶5個基因進行RNA編輯分析，共檢測到41個RNA編輯位點且都是C-T轉換，其中完全編輯位點27個，不完全編輯位點14個。對RNA編輯位點的氨基酸變化進行分析發(fā)現(xiàn)，RNA編輯引起蛋白質多肽鏈中疏水氨基酸含量增加，導致蛋白質穩(wěn)定性增強。另外，發(fā)現(xiàn)2個由RNA編輯產生的新的終止密碼子，一個位于atp6第787位點，另一個位于atp9第223位點，但是比對不育系、保持系及可育F1代中的RNA編輯頻率發(fā)現(xiàn)，ATP合成酶基因

9、RNA編輯與棉花CMS沒有直接的相關性。
　　7.基于不育系H276A線粒體蛋白編碼基因atp8基因上游6bp的缺失，開發(fā)了一對可以鑒別棉花雄性可育胞質和不育胞質的分子標簽。對41份已知育性的棉花種質資源進行驗證，結果表明該分子標簽穩(wěn)定、可靠，為棉花CMS胞質資源的選育提供了一個有力的工具。
　　8.通過Illumina Hiseq4000測序平臺對不育系和保持系進行轉錄組學的研究中，共檢測到64，675個共同表達基因，篩選

10、出3603個差異表達基因(5.57％)其中1363上調表達，2240個下調表達基因。對差異表達基因進行進一步生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)76個差異表達基因參與了TCA循環(huán)、氧化磷酸化、糖酵解等與植物能量代謝相關途徑，且大部分基因顯著下調表達。同時，發(fā)現(xiàn)了一些編碼PPR蛋白、MYB轉錄因子及花藥特異表達的差異基因。隨機選取了15個可能與棉花CMS相關的差異表達基因進行實時熒光定量驗證，結果表明轉錄組測序結果可靠。對上述差異表達基因調控網(wǎng)絡進一步深